L-蘋果酸降解菌釀酒酵母降酸功能影響因素分析

王 英， 周劍忠， 夏秀東， 胡彥新， 李 瑩， 黃自蘇

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京210014）

有機酸是果酒組分之一，也是主要風(fēng)味物質(zhì)的主要組成成分，主要包括酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等，其中蘋果酸含量過高會使果酒有酸澀感，酒味粗硬。如何降低果酒中的蘋果酸含量一直是果酒釀造中一個亟待解決的問題。物理降酸法、化學(xué)降酸法和生物降酸法是目前果酒產(chǎn)業(yè)中的主要降酸方法，但物理和化學(xué)降酸方法對果酒的風(fēng)味影響較大。利用乳酸菌或酵母菌生長代謝降酸成為近年來果酒降酸的主要研究方向[1-4]。

果酒生物降解蘋果酸的途徑主要為蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malo-lactic Fermentation，MLF）和蘋果酸-酒精發(fā)酵（Malo-alcoholic Fermentation，MAF）。MLF主要利用乳酸菌將葡萄酒中的蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，其特點是有選擇性的降酸，并且是在酒精發(fā)酵之后進行[5-8]。MAF是通過裂殖酵母利用糖作底物生成酒精外，還能在厭氧條件下分解蘋果酸，最終生成乙醇和CO2，但是裂殖酵母發(fā)酵能力較弱，且會使果酒產(chǎn)生不良?xì)馕禰9]。目前，有研究者從自然發(fā)酵的果酒中篩選具有優(yōu)良降解L-蘋果酸功能又具有優(yōu)良發(fā)酵性能的釀酒酵母，在果酒發(fā)酵的過程中使酒精發(fā)酵和降酸同時進行，達到簡化果酒發(fā)酵工藝[4，10-12]。

大量的研究結(jié)果表明，環(huán)境因素（時間、底物濃度、接種量等）對微生物的功能特性的發(fā)揮有很大的影響[13-15]。為了更好的發(fā)揮微生物的功能，研究者利用正交設(shè)計、響應(yīng)曲面、中心組合設(shè)計等實驗方法對影響微生物功能特性的條件進行優(yōu)化，為充分發(fā)揮菌株的功能特性提供指導(dǎo)[16-18]。

作者以實驗室保存的具有降L-蘋果酸功能的釀酒酵母菌株FM-S-115為研究對象，研究溫度、接種量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、SO2質(zhì)量濃度等因素對FM-S-115菌株降酸能力的影響，并利用中心組合設(shè)計對該菌株的降酸條件進行優(yōu)化，確立FM-S-115菌株的最佳降酸條件，為FM-S-115菌株在果酒生產(chǎn)中應(yīng)用提供技術(shù)支持，同時為果酒的生物降酸提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

降酸酵母FM-S-115，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程實驗室分離、鑒定并保存保藏。

1.2 試劑與設(shè)備

甲醇（色譜純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；L-蘋果酸（分析純）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

PDA培養(yǎng)基：去皮土豆200 g，切成小塊加水至1 L，煮沸1 h，雙層紗布過濾，補水至1 L，加入20 g葡萄糖；固體培養(yǎng)基：添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂。

LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海恒科技有限公司產(chǎn)品；THZ-C-1臺式冷凍恒溫震蕩機：太倉市實驗設(shè)備廠產(chǎn)品；SevenEasy plus pH儀：梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品；TGL-16C臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；超級水浴鍋：常州國華電器有限公司產(chǎn)品；LC2030型高效液相色譜儀：北京安捷倫科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備 在PDA液體培養(yǎng)基中接種菌株FM-S-115，培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體，用新鮮的PDA培養(yǎng)液洗滌2次后重懸，調(diào)整A600nm值為2.10～2.15，作為L-蘋果酸降解試驗的接種菌液。

1.3.2 降酸實驗設(shè)計 黑莓經(jīng)打漿酶解后，5 000 r/min離心10 min， 上清液用依次用0.8 μm 和0.22 μm的無菌濾膜進行過濾。以含有體積分?jǐn)?shù)50%的無菌黑莓清汁和50%的PDA液體培養(yǎng)基的混合液體為測定菌株FM-S-115降酸性能的培養(yǎng)液體，加入無菌的L-蘋果酸溶液，使體系中L-蘋果酸終質(zhì)量濃度為4 g/L，除非特別說明，接種量為體積分?jǐn)?shù)4%，培養(yǎng)溫度為28℃，100 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為9 d，HPLC檢測，每次試驗重復(fù)3次。

1.3.3 樣品處理 發(fā)酵液樣品經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清，用雙蒸水稀釋合適倍數(shù)后經(jīng)0.22 μm膜過濾后進行HPLC測定。

1.3.4 L-蘋果酸質(zhì)量濃度的檢測 色譜條件色譜柱：Atlantis C18 柱 （46 mm×250 mm，5 μm）；流動相：V（甲醇）∶V（0.01 mol/L 緩沖溶液 KHPO4）=3∶97，pH 2.8；流量：0.7 mL/min；進樣體積 20 μL；檢測波長：210 nm；柱溫：室溫。

式中：C0為降解前蘋果酸（檸檬酸）的質(zhì)量濃度；C1為降解后蘋果酸（檸檬酸）的質(zhì)量濃度。

1.3.5 單因素實驗 主要考慮發(fā)酵溫度、接種量、SO2質(zhì)量濃度、發(fā)酵時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為菌株FM-S-115的降酸能力的影響因素，在各因素試驗中采用1.3.2和1.3.3所述的方法進行樣品處理和蘋果酸濃度的檢測。

1.3.6 FM-S-115降酸條件優(yōu)化 基于單因素試驗結(jié)果，同時結(jié)合果酒釀造過程中的可調(diào)控條件，選取接種量、培養(yǎng)溫度和SO2質(zhì)量濃度為3個主要因素，在蘋果酸質(zhì)量濃度為4 g/L的黑莓汁和PDA混合液體培養(yǎng)基中，100 r/min搖床振蕩培養(yǎng)9 d，在利用中心組合設(shè)計（Central Composite Design，CCD）軟件生成響應(yīng)面分析實驗方案，具體內(nèi)容見表1。預(yù)測FM-S-115降酸條件的最優(yōu)條件組合。

表1 試驗因素水平及編碼Table 1 Codes and levels of the test

1.3.7 響應(yīng)面模型的驗證 按照獲得的二次回歸方程所預(yù)測的最佳組分配比條件進行降酸，通過搖瓶發(fā)酵降酸試驗，驗證模型的有效性。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 用Excel 2010軟件對單因素實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析與作圖，用Design-expert 8.0.5軟件進行實驗設(shè)計和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對FM-S-115的降酸率影響

溫度是影響菌體生長的主要因素之一，同時也是影響菌株功能特性的主要因素。培養(yǎng)溫度在20～32℃范圍內(nèi)，菌株FM-S-115對L-蘋果酸的降解能力隨發(fā)酵溫度的增加其降酸能力不斷增加，在26℃時，菌株FM-S-115的降酸能力最強，降酸率達29.81%。之后隨著溫度的增加，其降酸能力呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于在適宜菌體生長的溫度條件下，菌體密度高，相應(yīng)的菌體的降酸功能就會增加。綜上所述，發(fā)酵時間控制在26℃左右，F(xiàn)M-S-115菌株的降酸能力較好。

2.2 接種量對蘋果酸降解率的影響

菌體接種量的變化直接影響著菌體的生長趨勢，當(dāng)菌體接種量過低時，菌體的適應(yīng)性降低，相應(yīng)的延滯生長期就會延長，但菌體的接種量過大，菌體會很快進入生長穩(wěn)定期，消耗大量的營養(yǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)供不應(yīng)求，影響菌體的生長。

2.3 SO2質(zhì)量濃度對FM-S-115降酸率的影響

由于SO2具有抗氧化和抑制微生物的生長的功能，因此在果酒的發(fā)酵過程中，常被用來作為抑菌劑和護色劑使用[19-20]。因此，作者對SO2質(zhì)量濃度變化對菌株FM-S-115的降酸特性的影響進行了分析。菌株FM-S-115對L-蘋果酸的降解能力隨SO2質(zhì)量濃度的變化而變化，當(dāng)SO2質(zhì)量濃度在0～80 mg/L范圍內(nèi)，菌株FM-S-115的降酸能力隨SO2質(zhì)量濃度的增加而增加；SO2質(zhì)量濃度大于80 mg/L時，菌株的降酸能力隨SO2質(zhì)量濃度的增加而減小。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對FM-S-115降酸率的影響

在果酒的釀造過程中，前期菌落結(jié)構(gòu)組成豐富，具有多種多樣的酵母類群，如漢森酵母（Hanseniaspora）、畢赤酵母 （Pichia）、 假絲酵母（Candida）、接合酵母（Zygosaccharomyces）等，但在發(fā)酵后期，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是主要成員，因其對酒精具有較高的耐受性[21-22]。菌株FM-S-115對L-蘋果酸的降解能力隨酒精體積分?jǐn)?shù)的變化而變化，體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)低于10%時，菌株的降酸能力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而逐漸減小，但是降低不顯著（P＞0.05）；此結(jié)果表明，菌株FM-S-115對酒精具有較高的耐受性，并且低濃度的酒精對該菌株的其降酸功能影響不大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在大于10%，降酸能力急劇下降。

2.5 培養(yǎng)時間對FM-S-115降酸率的影響

菌株FM-S-115對L-蘋果酸的降解能力隨發(fā)酵時間的延長其降酸率呈現(xiàn)增加趨勢，在發(fā)酵初期，降酸率增加比較明顯，但隨著發(fā)酵時間的延長，降酸率增加幅度逐漸呈現(xiàn)減小的趨勢。

2.6 蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對FM-S-115降酸率的影響

適當(dāng)?shù)脑黾犹荚礉舛?，有利于菌體的生長，但體系中碳源濃度過高時，體系的滲透壓增大，高的滲透壓對菌體生長會有不同的抑制作用。體系中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株FM-S-115的降酸能力隨著體系中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

2.7 FM-S-115降酸條件的優(yōu)化

根據(jù)前期的單因素試驗結(jié)果，結(jié)合在果酒釀造中可操控的實驗因素，對接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和SO2質(zhì)量濃度（C）進行了3因素3水平響應(yīng)面分析試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到菌株FM-S-115降酸率預(yù)測值（Y）對編碼自變量A、B和C的二次多項回歸方程：

式中，Y為菌株的降酸率的預(yù)測值；A、B、C為3個自變量的編碼值。

從回歸模型方差分析結(jié)果可知，該模型的F值為52.69，P＜0.000 1，說明該模型極顯著；且失擬項的F值為1.49，P值為0.337 0，大于0.05，說明方程具有良好的擬合性和實用性，實驗誤差較小。另外，該模型的矯正系數(shù)R2Adj=0.960 8，說明該模型能解釋96.08%的菌株FM-S-115降酸率的變化。從模型中可以看出，根據(jù)各影響因素系數(shù)的絕對值大小可以得到各因素對FM-S-115菌株的降酸率的貢獻大小順序為培養(yǎng)溫度＞接種量＞SO2質(zhì)量濃度。由回歸方差分析可知，培養(yǎng)溫度、接種量和SO2質(zhì)量濃度對FM-S-115菌株的降酸率的影響都處于顯著水平。培養(yǎng)溫度和接種量存在顯著的交互作用，培養(yǎng)溫度與SO2質(zhì)量濃度存在顯著的交互作用，對FM-S-115菌株的降酸率影響較大。接種量和SO2質(zhì)量濃度的交互作用不顯著。

根據(jù)回歸方程，利用Design Expert軟件做出兩因子交互作用的響應(yīng)面及其等高線，培養(yǎng)溫度和SO2質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度和接種量、接種量和SO2質(zhì)量濃度的交互作用分別見圖1～3。如果一個響應(yīng)曲面坡度相對平緩，表明處理條件的變化對響應(yīng)值較小，相反，響應(yīng)曲面的坡度陡峭，表明響應(yīng)值對于處理條件的改變非常敏感；等高線若為橢圓，說明兩個因素交互作用明顯，等高線圖若為圓形，說明兩者交互作用不明顯[23]。

圖1顯示了接種量為5%時，培養(yǎng)溫度和SO2質(zhì)量濃度的交互作用對降酸率的影響，從響應(yīng)曲面圖中可以看出，培養(yǎng)溫度和SO2質(zhì)量濃度對菌株FM-S-115的降酸率的貢獻率相當(dāng)，從等高線圖中可以看出，培養(yǎng)溫度和SO2質(zhì)量濃度交互作用不顯著。圖2顯示了SO2質(zhì)量濃度為80mg/L時，接種量和發(fā)酵溫度對菌株FM-S-115的降酸率的影響，從響應(yīng)曲面圖中可以看出，接種量和發(fā)酵溫度對菌株FM-S-115的降酸率的貢獻率相當(dāng)，從等高線圖中，可以看出，接種量和發(fā)酵溫具有明顯的交互作用。圖3顯示了培養(yǎng)溫度為26℃時，SO2質(zhì)量濃度和接種量對菌株FM-S-115的降酸率的影響，從響應(yīng)曲面圖中可以看出，接種量對菌株FM-S-115的降酸率的貢獻率高于SO2質(zhì)量濃度，從等高線圖中，可以看出，接種量度和SO2質(zhì)量濃度具有顯著的交互作用作用。

圖1 SO2質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度對菌株FM-S-115降酸率的交互效應(yīng)Fig.2 Reciprocal effects of SO2concentrations and temperature on deacidification ratio of FM-S-115 strain

圖2 接種量和培養(yǎng)溫度對菌株FM-S-115降酸率的交互效應(yīng)Fig.2 Reciprocal effects of inoculation amounts and temperature on deacidification ratio of FM-S-115 strain

圖3 SO2質(zhì)量濃度和接種量對菌株FM-S-115降酸率的交互效應(yīng)Fig.3 Reciprocal effects of SO2concentrations and inoculation amount on deacidification ratio of FM-S-115 strain

由二次多項回歸方程得出3個因素的最佳值為溫度為26.26℃ 接種量為5.15%，SO2質(zhì)量濃度為81.08 mg/L，菌株FM-S-115的降酸率的預(yù)測值為37.98%。采用上述優(yōu)化后的條件，進行驗證，3次重復(fù)，結(jié)果顯示，F(xiàn)M-S-115的降酸率為38.11%，與預(yù)測值37.98%接近，說明該實驗?zāi)Ｐ涂刹僮餍愿摺?/p>

3 結(jié)語

作者通過對影響菌株FM-S-115降酸能力的因素進行系統(tǒng)的研究，在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取接種量、發(fā)酵溫度和SO2質(zhì)量濃度為影響FMS-115降酸能力的3個主要因素，利用Central Composite Design實驗設(shè)計建立菌株FM-S-115降酸性能的優(yōu)化回歸數(shù)學(xué)模型，該模型在本實驗條件范圍內(nèi)能很準(zhǔn)確的預(yù)測顯示菌株FM-S-115的降酸能力。方差分析結(jié)果顯示，各因素對FM-S-115菌株的降酸率的貢獻大小順序為培養(yǎng)溫度＞接種量＞SO2質(zhì)量濃度。另外，培養(yǎng)溫度、接種量和SO2質(zhì)量濃度對FM-S-115菌株的降酸率的影響都處于顯著水平。培養(yǎng)溫度和接種量存在顯著的交互作用，培養(yǎng)溫度與SO2質(zhì)量濃度存在顯著的交互作用，對FMS-115菌株降酸率的影響較大。接種量和SO2質(zhì)量濃度的交互作用不顯著。

最佳優(yōu)化條件為：接種量 （體積分?jǐn)?shù)）5.15%，SO2質(zhì)量濃度81.08 mg/L，培養(yǎng)溫度為26.26℃，菌株FM-S-115的降酸率的預(yù)測值為37.98%。通過實際實驗，F(xiàn)M-S-115的降酸率為38.11%，與預(yù)測值非常接近，回歸分析和驗證實驗都證明該實驗?zāi)Ｐ偷暮侠硇院涂尚行浴?/p>