以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)新型黃原膠

王子朝， 朱 莉， 吳劍榮， 鄭志永， 高敏杰， 詹曉北*

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫214125）

黃原膠的安全性已得到FDA和WHO認可。同時，黃原膠良好的穩(wěn)定性、乳化性、懸浮性、增稠性和假塑性使其在食品、醫(yī)藥、日用化工、紡織和石油開采等領域得到廣泛應用[1-6]。黃原膠生產(chǎn)一般采用價格低廉的玉米淀粉作碳源，實驗室規(guī)模生產(chǎn)和研究也可用蔗糖和葡萄糖。隨著糧食價格不斷攀升和全球人口不斷增加，國內外許多學者都在研究采用一些工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品副產(chǎn)物來代替玉米淀粉實現(xiàn)黃原膠工業(yè)生產(chǎn)，如木糖、甘蔗糖漿、甜菜糖漿、乳清和脂肪酸等[7]。如果微生物可以利用甘油實現(xiàn)黃原膠工業(yè)生產(chǎn)，不僅可以緩解生物柴油副產(chǎn)物過剩和全球糧食短缺雙重危機，還可以降低黃原膠生產(chǎn)成本。作者采用馴化得到了一株可以利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠的野油菜黃單胞菌突變株，其生產(chǎn)的黃原膠與商品黃原膠相比，具有粘度低、透明性高、水化速率快和反復凍融處理后粘度增大的特點。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基組成

X.campestris NRRL B-1459：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。X.campestris WXLB-006經(jīng)馴化得到并保藏于本研究室。

X.campestris NRRL B-1459種子培養(yǎng)基組成（g/L）：蔗糖 20.0，魚粉蛋白胨 5.0，牛肉浸膏 3.0，酵母浸膏 1.0，pH 7.0。

X.campestris WXLB-006種子培養(yǎng)基與X.campestris NRRL B-1459基本一致，用100 g/L甘油替代蔗糖。

馴化培養(yǎng)基：馴化培養(yǎng)基初始組成為X.campestris NRRL B-1459種子培養(yǎng)基。隨著馴化過程進行，甘油質量濃度逐漸增加，蔗糖質量濃度逐漸降低，培養(yǎng)基中其它成分不變。

平板篩選培養(yǎng)基是在馴化培養(yǎng)基基礎上添加20 g/L瓊脂。

分批發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 40（或甘油 100），魚粉蛋白胨 1.5， 酵母浸膏 1.0，NaNO31.0，NH4Cl 1.0，MgSO42.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，K2HPO43.5，KH2PO42.0，pH 7.0。

補料發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油 40，其余成分與分批發(fā)酵培養(yǎng)基相同。

1.2 培養(yǎng)條件

1.2.1 種子培養(yǎng) 500 mL三角瓶裝液量50 mL，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉速200 r/min。

1.2.2 分批發(fā)酵 500 mL三角瓶裝液量50 mL，培養(yǎng)溫度30℃，接種體積分數(shù)10%，搖床轉速200 r/min。

1.2.3 補料發(fā)酵 7 L發(fā)酵罐（LiFlus GM BioTRON公司產(chǎn)品）裝液量3 L，接種體積分數(shù)10%，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵過程中用3 mol/L KOH和3 mol/L HCl調節(jié)pH維持在7.0。發(fā)酵0～24 h，通氣量0.5 vvm，攪拌轉速 200 r/min；24～60 h，通氣量 1.0 vvm，攪拌轉速400 r/min。 甘油流加策略：24～34 h，3 g/L/h；34～44 h，2 g/L/h；44～54 h，1 g/L/h。

1.3 材料與試劑

商品黃原膠（食品級）：購于山東淄博中軒生化有限公司；蔗糖、HCl、KOH、魚粉蛋白胨和 NaNO3等試劑：購于國藥集團化學試劑有限公司；Trizol RNA提取試劑盒和第一條鏈cDNA合成試劑盒等：購于生工生物工程（上海）有限公司。

1.4 馴化過程

將X.campestris NRRL B-1459培養(yǎng)在種子培養(yǎng)基中，當菌體生長進入對數(shù)期，按體積分數(shù)10%接種量接入含有15 g/L蔗糖和5 g/L甘油種子培養(yǎng)基中，然后按同樣接種量在此培養(yǎng)基中連續(xù)傳代10次后，取1 mL對數(shù)生長期種子液適當稀釋后涂布到相應含有15 g/L蔗糖和5 g/L甘油平板篩選培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌體長出來之后，挑取大、透明且凸起的單菌落接種到含有10 g/L蔗糖和10 g/L甘油種子培養(yǎng)基中進行下一輪馴化、篩選。在接下來連續(xù)馴化和篩選過程中，蔗糖質量濃度逐漸降為0 g/L，而甘油質量濃度則逐漸增加至100 g/L。

1.5 多糖樣品的提取與純化

發(fā)酵結束后，向發(fā)酵液中加入3倍體積去離子水進行稀釋，然后20 000 g離心30 min除菌體。向離心得到的上清中加入3倍體積無水乙醇沉淀多糖，40℃、0.1 MPa下干燥48 h得到多糖樣品。

1.6 分析方法

紫外可見分光光度計于600 nm下測量菌懸液吸光度并折算為菌體干質量；蔗糖和甘油濃度測定采用高效液相色譜法；多糖用2 mol/L三氟乙酸水解后采用Dionex離子色譜儀進行單糖組分測定；多糖樣品與溴化鉀充分研磨壓片后，采用Nexus 470紅外光譜儀在400～4000 cm-1內對多糖進行紅外掃描；用Agilent 800 MHz核磁共振儀對多糖進行核磁分析，以D2O作內標物；采用高效體積排阻色譜測定多糖相對分子質量；采用安東帕Physica MCR301高級旋轉流變儀測量1.0 g/dL多糖溶液流變學特性，測量溫度25℃[8]。

1.7 RT-PCR分析

將生長進入指數(shù)后期的X.campestris NRRL B-1459和X.campestrisWXLB-006用去離子水洗滌并離心收集，然后采用Trizol RNA試劑盒提取總RNA，并用第一條鏈cDNA合成試劑盒合成第一條鏈的cDNA，按試劑盒操作方法進行提取和合成。以16s rRNA作為內參基因且每個樣品的RT-PCR過程均重復3次，最終實驗結果為3次結果平均值。PCR擴增采用40個循環(huán)，每個循環(huán)依次為：94℃30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s；40個循環(huán)之后 72 ℃處理10 min以終止反應并建立PCR產(chǎn)物溶解曲線。采用LightCycler（version 3.3）軟件分析計算目的基因相對表達量。根據(jù)NCBI中X.campestris ATCC 33913基因序列，使用Premier 5.0軟件設計目的基因上下游引物用于RT-PCR，引物序列見表1，并由生工生物工程（上海）有限公司合成引物。

表1 RT-PCR引物和引物序列Table 1 Primers and relevant sequences used for RT-PCR

1.8 黃原膠的水化速率測定

兩種黃原膠樣品分別加入去離子水、pH 5.5水溶液、質量分數(shù)1.0%NaCl溶液和1.0%蔗糖溶液中測量其在不同溶液中水化速率，黃原膠樣品一次性加入并使其質量分數(shù)為1.0%。磁力攪拌上25℃、300 r/min攪拌溶解。溶解過程中固定時間間隔用Brookfield DV-II粘度計25℃、3號轉子、6 r/min測量各溶液粘度。

1.9 反復凍融對膠溶液粘度的影響

質量分數(shù)1.0%新型黃原膠和商品黃原膠溶液在-20℃冰箱中保存24 h，然后于室溫下放置24 h。重復此凍融過程5次，每次均用Brookfield DV-II粘度計25℃、3號轉子、6 r/min測定各溶液粘度。

1.10 透射電子顯微鏡觀察

將-20℃凍融處理前后的新型黃原膠溶液采用日立H-7650透射電子掃描顯微鏡進行觀察。

2 結果與討論

2.1 X.campestris NRRL B-1459和X.campestris WXLB-006發(fā)酵性能對比

通過基因改造可以提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量，但轉基因技術的潛在危害一直受到人們質疑，尤其在食品領域[9]。馴化是以達爾文進化論為基礎的自然選擇過程，其安全性相對較高[10]。馴化得到的突變株X.campestris WXLB-006，其菌體生長時間（24 h）、發(fā)酵周期 （60 h）、 生物量 （1.65 g/L） 和黃原膠產(chǎn)量（23.5 g/L）與原始菌株X.campestris NRRL B-1459基本一樣（圖 1（a）和（b））。 馴化效果可以從圖 1（c）和（d）看出，X.campestris NRRL B-1459 不能在 100 g/L甘油培養(yǎng)基中生長；而X.campestris WXLB-006可以利用100 g/L甘油生長并合成黃原膠，且搖瓶中黃原膠產(chǎn)量達到17.8 g/L。

許多學者通過馴化得到了類似結果，Kalogiannis等[11]采用200 g/L甜菜糖蜜對X.campestris ATCC 1395馴化5輪后使黃原膠產(chǎn)量達到40.5 g/L。Wang et al.[12]在含有醋酸培養(yǎng)基上對Aureobasidium pullulans CCTCC M2012259連續(xù)馴化20輪之后，分離得到一株突變株A.pullulans ARH-1。與原始菌株相比，突變株利用稻殼水解液發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的產(chǎn)量由15.6 g/L增加到22.2 g/L，發(fā)酵周期由60 h縮短至48 h。

2.2 黃原膠性能對比

通過單糖組成分析發(fā)現(xiàn)，新型黃原膠中只含有葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，且3種單糖摩爾比為葡萄糖：甘露糖：葡糖糖醛酸=2.0：1.63：1.0，這與商品黃原膠比較相近（2.0：1.85：1.0）。 此外，新型黃原膠的紅外和核磁共振圖譜與商品黃原膠相吻合（圖未給出），進一步說明其是黃原膠。這也與Sutherland[13]報道一致，即野油菜黃單胞菌只能產(chǎn)生黃原膠唯一一種胞外多糖。

圖1 X.campestris NRRL B-1459和X.campestris WXLB-006利用40 g/L蔗糖和100 g/L甘油搖瓶發(fā)酵結果Fig.1 Flask culture profiles of X.campestris NRRL B-1459 and X.campestris WXLB-006 with 40 g/L sucrose and 100 g/L glycerol as carbon sources

新型黃原膠相對分子質量（3.0×106）僅為商品黃原膠（5.8×106）一半左右，且其水溶液粘度低于商品黃原膠。低粘度黃原膠在食品和醫(yī)藥等領域比較受歡迎，雖然可以采用物理、化學或者酶等方法降低黃原膠粘度[14]，但是通過發(fā)酵直接得到這一低粘度黃原膠，不僅可以省去黃原膠在處理過程中能耗，還可以提高產(chǎn)品安全性。

2.3 RT-PCR

通過RT-PCR對兩株菌中甘油代謝相關基因相 對轉錄水平 分 析 發(fā) 現(xiàn) （圖 2），X.campestris WXLB-006中甘油通道蛋白、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶和果糖-1，6-二磷酸醛縮酶基因的相對表達量均高于原始菌株，依次為：glpD （8.53）＞glpF（7.64） ＞ glpK （6.61） ＞ fbp （5.79）， 說 明 X.campestris WXLB-006可以利用甘油生長并合成黃原膠的原因與其體內甘油代謝相關基因的激活有關。圖1（d）中甘油做碳源時黃原膠產(chǎn)量（17.8 g/L）、底物轉化率（25%）和發(fā)酵周期（120 h）均不如以蔗糖做碳源時發(fā)酵結果（圖 1（a）和（b））。 合成黃原膠的前體物質是六碳單元（UDP-葡萄糖，GDP-甘露糖和UDP-葡萄糖醛酸），蔗糖主要通過ED途徑為黃原膠合成提供前體物質[5]，而甘油在合成黃原膠前體物質時糖異生是必經(jīng)途徑[15]，這可能是導致甘油做碳源時黃原膠產(chǎn)量和底物轉化率均較低的原因。其他學者在以甘油為碳源進行不同產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)時遇到了同樣發(fā)酵周期長和底物轉化率低的問題[16-17]。

2.4 補料發(fā)酵

X.campestris WXLB-006可以利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)一種新型黃原膠，但發(fā)酵周期長和底物轉化率低限制了其工業(yè)應用。高攪拌轉速引起的剪切力會對菌體造成機械損傷[18-19]；同時，高底物質量濃度不僅抑制野油菜黃單胞菌生長[20]，還會造成碳溢流[21]。所以，作者選擇初始甘油質量濃度40 g/L，甘油流加策略為：24～34 h，3 g/L/h；34～44 h，2 g/L/h；44～54 h，1 g/L/h。在菌體生長階段 （0～24 h）采用0.5 vvm和200 r/min，24～60 h 采用 1.0 vvm 和 400 r/min。

由圖3可以看出，菌體生長階段采用低通氣量和低攪拌轉速，X.campestris WXLB-006生物量由1.65 g/L增加到1.94 g/L，生物量的提高可以增加黃原膠產(chǎn)量。黃原膠合成屬于GadenⅡ型，即菌體進入穩(wěn)定期之后開始合成黃原膠，但隨著黃原膠合成并在發(fā)酵液中積累，發(fā)酵液的傳氧和傳質受到限制。因此，發(fā)酵中后期采用高通氣量和高攪拌轉速提高發(fā)酵體系的傳氧和傳質可以提高黃原膠產(chǎn)量。同時，變速流加甘油策略可以減少碳溢流而進一步提高黃原膠產(chǎn)量。通過以上策略，黃原膠產(chǎn)量由17.8 g/L提高到33.9 g/L，發(fā)酵周期由120 h縮短至60 h（圖3）。發(fā)酵前期低通氣量和低攪拌轉速還可以降低由高通氣量和高攪拌轉速所引起的泡沫而導致的染菌率。

圖2 兩株菌中甘油代謝途徑相關基因的相對轉率水平Fig.2 Relative transcription level of glycerol metabolism related genes in two strains

圖3 X.campestris WXLB-006采用變通氣量和變攪拌轉速補料發(fā)酵結果Fig.3 Time courses of X.campestris WXLB-006 with variable aeration rate and stirring speed in fedbatch fermentation

2.5 水化速率

當前，黃原膠以其在質量分數(shù)1.0%KCl溶液中粘度進行分級，但這種分級方法忽視了黃原膠的一些實際應用（如透明性和水化速率）。商品黃原膠在去離子水中攪拌溶解60 min后達到其飽和粘度（圖 4（a）），而新型黃原膠僅需 20 min（圖 4（b）），這一時間為商品黃原膠三分之一。

圖4 商品黃原膠和新型黃原膠水化速率Fig.4 Hydration rate of commercial xanthan and new xanthan

雖然蔗糖、NaCl和弱酸對兩種黃原膠的水化時間均有延長 （商品黃原膠從60 min增加到90 min；新型黃原膠從20 min增加到30 min），但是新型黃原膠的水化速率仍快于商品黃原膠。新型黃原膠快速水化的特性，不僅可以減少在攪拌溶解過程中空氣的裹入，還可以降低攪拌設備投入，將其應用到速溶類食品中效果極佳。

2.6 反復凍融

很多食品都會選擇添加一定量增稠劑、乳化劑或穩(wěn)定劑等，這些食品在食用之前會因其中添加成分在冷凍條件下流變學性質的改變而發(fā)生形變，進而影響其外形和口感[22]。圖5（a）中，商品黃原膠粘度幾乎不受-20℃反復凍融影響，始終維持在11 500 mPa·s左右；但新型黃原膠粘度隨凍融次數(shù)增加而逐漸增大，從初始 1 100 mPa·s增大到 1 850 mPa·s，且凍融處理3次以后，粘度基本穩(wěn)定在1 850 mPa·s。

圖5 冷凍對商品黃原膠和新型黃原膠粘度影響Fig.5 Refrigerated storage on the viscosity of commercial and new xanthan

通過透射電鏡對凍融前后新型黃原膠溶液觀察發(fā)現(xiàn)（圖6），反復凍融使新型黃原膠在溶液中發(fā)生聚集，具體原因還有待進一步研究。新型黃原膠溶液凍融處理后粘度增大的特性使其應用到食品中意義重大。首先，復配使用時可以彌補其它增稠劑在凍融處理中粘度降低的不足，維持產(chǎn)品形態(tài)；其次，可以減少肉制品在凍融過程中肉汁流失，提高肉制品色澤和品質；最后，在冷鏈運輸過程中，可以減少冰晶對產(chǎn)品結構破壞，提高產(chǎn)品品質并延長貨架期[23]。

圖6 凍融前后新型黃原膠溶液透射電鏡圖Fig.6 TEM images of new xanthan solutions before and after freeze-thaw

3 結 語

通過馴化得到了一株可以利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠的野油菜黃單胞菌突變株。RT-PCR結果顯示突變株中甘油代謝相關基因的相對表達量均明顯高于出發(fā)菌株。采用不同發(fā)酵策略使黃原膠產(chǎn)量達到33.9 g/L，發(fā)酵周期縮短至60 h，且發(fā)酵得到的黃原膠具有粘度低、透明性高、水化速率快和凍融處理后粘度增大的特性。