仔豬腸道發(fā)育和氨基酸營養(yǎng)調(diào)控機(jī)制

譚碧娥，王婧，印遇龍

（中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410125）

腸道生長是仔豬生長發(fā)育的核心和快速生長的基礎(chǔ)。腸道是消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，也是抵抗病原體的重要屏障。由于仔豬的腸道發(fā)育不夠健全，早期斷奶極易引起仔豬腸道黏膜屏障損傷及消化功能紊亂，繼而導(dǎo)致自由采食量下降，能量攝入不足，腹瀉，甚至死亡。通過優(yōu)化仔豬日糧營養(yǎng)水平促進(jìn)腸道發(fā)育，改善腸道黏膜損傷，是緩解仔豬早期斷奶應(yīng)激的有效途徑[1]。氨基酸是小腸優(yōu)先利用的重要營養(yǎng)物質(zhì)，參與了細(xì)胞生長過程中各種重要的生理生化過程[2]，小腸黏膜氨基酸的利用對腸道發(fā)育和維持腸道健康具有重要作用。

1 仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育和斷奶適應(yīng)性變化規(guī)律

仔豬腸道的發(fā)育過程主要分三個(gè)階段：1）胚胎期，腸道的初步形成與生長；2）哺乳期，腸道的快速發(fā)育；3）斷奶期，腸道的損傷與修復(fù)。

1.1 胚胎期腸道形成與生長

腸道的器官發(fā)生始于早期胚胎發(fā)育階段，由內(nèi)胚層細(xì)胞遷移形成間質(zhì)細(xì)胞環(huán)繞的簡單腸管，且腸管壁層存在增殖細(xì)胞[3]。隨后，由未分化細(xì)胞形成的層狀內(nèi)胚層，經(jīng)前端至尾端轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂泻唵沃鶢钌掀ぜ?xì)胞的新生絨毛，絨毛細(xì)胞繼而分化為具有微絨毛結(jié)構(gòu)、刷狀緣水解酶以及營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的腸道上皮細(xì)胞。增殖細(xì)胞在初生絨毛之間的區(qū)域聚集，并侵入基底間質(zhì)區(qū)形成原始隱窩[4]。隱窩中含有多能干細(xì)胞，在隱窩底部增殖，并沿著隱窩—絨毛軸遷移至絨毛頂端，在此過程中分化為吸收型上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞[5]。此外，腸道上皮還存在M細(xì)胞和塔夫細(xì)胞[6]。絨毛由分化的腸上皮細(xì)胞排列形成后，胎兒開始吞咽并消化羊水，胎兒從羊水中吸取自身所需的10%～14%的營養(yǎng)和能量用于自身組織合成及發(fā)育[7]。除了營養(yǎng)物質(zhì)，羊水中還包含了具有生物活性的非營養(yǎng)性物質(zhì)，如生長因子和激素，對調(diào)節(jié)胎兒腸道發(fā)育至關(guān)重要。

1.2 哺乳仔豬腸道的發(fā)育

新生仔豬為了適應(yīng)由宮內(nèi)生長環(huán)境到獨(dú)立的宮外生長環(huán)境的轉(zhuǎn)變，腸道結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了巨大的改變。仔豬出生后，初乳刺激腸道快速生長，主要表現(xiàn)為腸道DNA合成和蛋白含量增加，細(xì)胞周轉(zhuǎn)速率下降，并伴隨著絨毛及微絨毛表面積的擴(kuò)張。出生后24 h小腸相對體重之比是出生時(shí)的2倍[8]，腸道隱窩深度與絨毛高度分別增加了40%和30%[9]，腸道消化面積增加了50%[10]。在初生的2～3天中，腸道上皮細(xì)胞攝取初乳中的蛋白質(zhì)（免疫球蛋白、激素、生長因子等）并儲存在消化液泡中，使細(xì)胞體積急劇增大。隨著腸道逐漸成熟，消化液泡由近端空腸至遠(yuǎn)端回腸慢慢消失，這一過程大約持續(xù)2～3周[11]。腸道通過折疊增加自身表面積，腸黏膜折疊形成縱向的環(huán)形皺襞，每個(gè)皺襞中包含多個(gè)隱窩—絨毛單位。仔豬出生后1周，腸黏膜血流量增加，絨毛長度也隨之提高，且絨毛表面逐漸出現(xiàn)大量的橫向溝紋，但隨著仔豬日齡的增加，絨毛變短變粗，絨毛橫向溝紋的數(shù)量與深度減少[11]。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)，仔豬空腸微絨毛在1日齡時(shí)長、細(xì)且稀疏，隨著日齡的增長絨毛逐漸變?yōu)槎獭⒋智颐芗?，同時(shí)腸道杯狀細(xì)胞數(shù)逐漸增加（圖1）。仔豬14日齡時(shí)，絨毛由初生時(shí)的指狀變?yōu)樯酄?，隱窩深度進(jìn)一步加深，絨毛表面與7日齡相比變得光滑[13]。

1.3 斷奶仔豬腸道的損傷修復(fù)

圖1 不同日齡哺乳仔豬（1、7、14、21日齡）和14日齡早期斷奶仔豬（斷奶后第1、3、5、7天）空腸微絨毛結(jié)構(gòu)（掃描電鏡，放大倍數(shù)× 200）（引自：Wang等[12]）Fig. 1 The structure of jejunal microvillus in 1, 7, 14, 21-d-old suckling piglets and piglets on days 1, 3, 5, 7 post-weaning at 14 d of age (scanning electron microscopy, magnification × 200) (Quoted from Wang et al. [12])

在斷奶階段，仔豬腸道面臨著許多應(yīng)激因子，影響著腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長發(fā)育[9]。斷奶應(yīng)激造成腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能損傷，誘導(dǎo)腸道紊亂和腹瀉[14-15]。在斷奶后的前2天，腸黏膜相對重量（相對于體重）可下降20%～30%[16]，腸黏膜屏障損傷最嚴(yán)重發(fā)生在斷奶后的第3～5天[14,17]。腸黏膜屏障受損主要表現(xiàn)為腸道絨毛萎縮，仔豬21日齡斷奶后24 h內(nèi)，絨毛高度降低了75%，絨毛高度與隱窩深度比也隨之降低。14日齡斷奶仔豬空腸和回腸絨毛的高度和密度在斷奶第3 天明顯降低，隨后在第7天逐漸恢復(fù)（圖1）。同時(shí)，14日齡早期斷奶導(dǎo)致了斷奶后第3天和第5天空腸中E-cadherin和occludin的基因表達(dá)量以及occludin和ZO-1的蛋白水平顯著降低，腸道屏障功能受損[12]。伴隨著絨毛高度的降低和隱窩深度的增加，腸道刷狀緣酶活也在斷奶后的第4～5天降至最低值[18]。

腸道黏膜具有損傷后快速修復(fù)的能力[19]。腸黏膜屏障在斷奶后第5～10天才恢復(fù)至正常水平[16]。Hu等[14]發(fā)現(xiàn)，絨毛高度和隱窩深度在斷奶后的第14天可恢復(fù)至斷奶前水平。仔豬腸道損傷后的修復(fù)是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，包括了腸上皮細(xì)胞的重建、細(xì)胞增殖、凋亡、血管再生與黏膜重塑[20]。小腸絨毛的萎縮主要是由于腸道細(xì)胞增殖速度緩慢，以及大量成熟腸細(xì)胞在絨毛頂端脫落。腸道絨毛高度的降低導(dǎo)致了腸道上皮細(xì)胞從隱窩底部至絨毛頂端遷移距離 （EMD）縮短，EMD在斷奶第5天時(shí)顯著降低。EMD的縮短使腸上皮細(xì)胞遷移速度加快，與斷奶第0天比，腸上皮細(xì)胞遷移速度在斷奶后第2、4、8天時(shí)分別加快了1.86、3.42和2.60倍[21]。腸黏膜損傷的快速重建，主要依靠已分化的腸上皮細(xì)胞而非隱窩區(qū)域未分化的細(xì)胞[22]。鉀離子通道的激活與多種細(xì)胞的生長或分化有關(guān)[23]。斷奶后鉀離子通道表達(dá)量的增加，在損傷后分化的腸上皮細(xì)胞的遷移過程中具有重要作用[12,22]。細(xì)胞內(nèi)多胺與腸黏膜的生長和修復(fù)進(jìn)程密切相關(guān)[24]。仔豬斷奶后的第1～3天空腸和回腸中亞精胺和精胺濃度增加，腸道多胺合成過程中的第一限速酶ODC基因和蛋白表達(dá)在斷奶第3天顯著升高[12]，可以作為腸道損傷修復(fù)的指征。

2 仔豬腸道黏膜上皮細(xì)胞氨基酸的代謝利用

2.1 腸道氨基酸代謝

日糧蛋白質(zhì)在被運(yùn)輸?shù)侥c細(xì)胞之前在消化道中被水解成小肽和游離AA[25]。日糧中20%～97%的AA被小腸首過代謝，只有低于20%的AA用于腸黏膜蛋白質(zhì)合成[3]。進(jìn)入腸道中的幾乎所有谷氨酸和天冬氨酸，67%～70%的谷氨酰胺，30%～40%的脯氨酸和35%的支鏈鏈(BCAA)被豬小腸分解[26-27]。許多研究結(jié)果表明，氨基酸而非血糖是小腸黏膜的主要能量來源[2]。Reeds等[28]采用外科手術(shù)和同位素技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，盡管小腸黏膜細(xì)胞攝取了大量的葡萄糖，但大多用于糖原的合成，僅5%被黏膜利用。日糧谷氨酰胺及與谷氨酰胺代謝有關(guān)的天冬氨酸、谷氨酸不僅為小腸黏膜提供能量，也是細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸及氧化型輔酶Ⅱ（NADP+）等物質(zhì)合成的前體和促進(jìn)劑，對維持黏膜的正常形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用[28]。體外培養(yǎng)的豬腸上皮細(xì)胞利用谷氨酰胺的基礎(chǔ)代謝和ATP生成均高于葡萄糖，驗(yàn)證了腸上皮細(xì)胞優(yōu)先利用谷氨酰胺作為能量來源的結(jié)論[29]。Yao等[30]發(fā)現(xiàn)，α-酮戊二酸（AKG）對腸道功能性氨基酸代謝具有節(jié)約效應(yīng)。作為連接細(xì)胞內(nèi)碳氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，AKG可直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)為腸道提供能量并劑量依賴性地抑制腸上皮細(xì)胞對谷氨酰胺和谷氨酸的降解，降低丙氨酸、天冬氨酸、氨和二氧化碳等代謝產(chǎn)物的形成，使更多的谷氨酰胺和谷氨酸用于機(jī)體蛋白質(zhì)的合成。腸道內(nèi)的細(xì)菌也會吸收和降解游離AA和小肽，產(chǎn)生氨、CO2、多胺、核苷酸、蛋白質(zhì)和其他氮源 (包括亞硝酸鹽、硝酸鹽和谷胱甘肽)。腸道細(xì)菌能降解所有的AA，主要涉及小腸中賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸和組氨酸的分解代謝[31-33]。

2.2 腸道氨基酸吸收和感應(yīng)

仔豬出生后3 h內(nèi)，單位質(zhì)量腸黏膜中天冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和脯氨酸的吸收率顯著下降；隨后，脯氨酸吸收率顯著增加，至7日齡達(dá)到最大值后逐漸降低，至28日齡脯氨酸吸收率趨于穩(wěn)定水平。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)速度的降低可能是由于腸黏膜單位面積內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的減少造成的，Yang[34]發(fā)現(xiàn)空腸中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體B0AT1、ATB0和EAAC1的表達(dá)水平隨著仔豬年齡增加而減少。但是天冬氨酸、蛋氨酸和賴氨酸的吸收率隨著日齡的增長顯著增加，至28日齡增加至最高值[35]。斷奶應(yīng)激降低了所有氨基酸的攝取率。仔豬出生后腸道的快速生長促進(jìn)了腸道總氨基酸吸收能力的增加，斷奶后出現(xiàn)的腸道絨毛萎縮和黏膜損傷會導(dǎo)致腸道氨基酸攝取率的短暫下降[35]。

腸道氨基酸的吸收由氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體介導(dǎo)。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以調(diào)控氨基酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)作用于相應(yīng)的受體，或直接啟動細(xì)胞信號，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)生理過程。Na+依賴性中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體SNAT2作為近年來發(fā)現(xiàn)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)感受體的典型代表，在調(diào)控氨基酸信號感應(yīng)中發(fā)揮重要作用[36]。氨基酸饑餓、精氨酸、谷氨酸或亮氨酸能誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞SNAT2的表達(dá)，而谷氨酰胺抑制其表達(dá)；采用mTOR RT2Profiler PCR Array分析發(fā)現(xiàn)，SNAT2抑制后主要調(diào)控mTORC1上游調(diào)控因子；抑制SNAT2顯著降低細(xì)胞增殖和蛋白合成[36]。PATs、CasR和T1R1/T1R3也是重要的氨基酸感應(yīng)受體。PAT1不僅能夠?qū)獍被嶂苯愚D(zhuǎn)運(yùn)入胞漿內(nèi)，還能夠作用于mTORC1[37]。PAT1能促進(jìn)質(zhì)子依賴性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)腸腔蛋白質(zhì)在腸道刷狀膜緣酸性小環(huán)境的消化[38]。T1R1/T1R3作為直接感受機(jī)體能量狀態(tài)和胞外氨基酸濃度的感受器，敲除后會直接影響氨基酸濃度作為信號傳遞到mTORC的過程[39]。此外，腸道微生物和宿主通過代謝感應(yīng)也能調(diào)控氨基酸的利用。Ren等[40]發(fā)現(xiàn)，病原菌ETEC感染情況下，微生物發(fā)生了顯著的變化，L.lactissubsp.lactis增加，進(jìn)而通過產(chǎn)生γ氨基丁酸（GABA）激活腸道免疫信號；GABA轉(zhuǎn)運(yùn)載體2通過調(diào)控GABA從細(xì)胞外轉(zhuǎn)至胞內(nèi)而終止GABA信號（圖2）。

圖2 腸道微生物和宿主互作調(diào)控腸道免疫反應(yīng)機(jī)制Fig. 2 The mechanisms of interactive regulation of intestinal microbe and host on immune responses

3 功能性氨基酸對仔豬腸道結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控作用

氨基酸在腸道的代謝對營養(yǎng)和健康有重要意義[41]。本課題組大量研究證明，氨基酸尤其是功能性氨基酸在黏膜代謝和損傷修復(fù)中具有關(guān)鍵作用[29,42-47]。每天食入的谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和血液谷氨酰胺進(jìn)入腸黏膜后，成為小腸能量的主要來源，為小腸養(yǎng)分的主動轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)提供足量的ATP。在腸黏膜應(yīng)激損傷修復(fù)過程中，精氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸等可作為線粒體能量基質(zhì)被利用，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞DNA合成和損傷修復(fù)[48]。Xiao等[49]研究發(fā)現(xiàn)，N-乙酰-L-半胱氨酸能促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)損傷的腸上皮細(xì)胞的線粒體生物合成，改善細(xì)胞TCA循環(huán)，減少細(xì)胞凋亡和死亡（圖3）。

精氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸是合成多胺的前體物，多胺與DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的生物代謝有關(guān)，在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，對新生仔豬細(xì)胞增殖和分化至關(guān)重要，是小腸黏膜生長、發(fā)育、成熟、適應(yīng)恢復(fù)所必需的物質(zhì)[50]，可促進(jìn)腸腺隱窩細(xì)胞的增殖、分化和移行，促進(jìn)腸黏膜的損傷修復(fù)[22]。Wang等[51]研究發(fā)現(xiàn)，哺乳仔豬灌服腐胺和脯氨酸提高斷奶后小腸黏膜多胺濃度和ODC蛋白表達(dá)，促進(jìn)小腸黏膜細(xì)胞增殖和分化，從而促進(jìn)黏膜成熟；脯氨酸顯著提高空腸ZO-1、occludin和claudin-3以及回腸 ZO-1和claudin-1的蛋白表達(dá)，促進(jìn)黏膜屏障功能。

圖3 氨基酸促進(jìn)腸道DNA合成和蛋白質(zhì)合成的通路Fig. 3 The pathway of amino acids improving DNA and protein synthesis in the intestine

mTOR可調(diào)控氨基酸利用，從而作為腸道功能調(diào)控的靶標(biāo)，調(diào)控作用包括蛋白質(zhì)合成、免疫反應(yīng)、線粒體功能、細(xì)胞增殖分化凋亡等[40,42,52-53]。精氨酸和Ala-Gln等通過激活mTOR信號通路促進(jìn)腸上皮細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)合成（圖3），同時(shí)抑制了泛素蛋白酶途徑UBE3A基因表達(dá)而抑制蛋白質(zhì)降解，從而促進(jìn)損傷修復(fù)[42,53]。精氨酸和GABA等可激活mTOR通路，調(diào)控機(jī)體免疫功能[40]。精氨酸通過調(diào)控細(xì)胞因子和抗體產(chǎn)生提高腸道免疫功能[52]；通過抑制了TLR4活性和NFκB的磷酸化，從而抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4-NFκB信號通路，緩解腸上皮細(xì)胞炎癥損傷[42]。GABA能被Th17細(xì)胞通過GABA受體感應(yīng)，從而激活mTOR信號通路，通過mTORS6K1-EGR2-GFI1通路影響腸道的Th17的活化以及IL-17的表達(dá)；抗生素處理情況下，補(bǔ)充高劑量GABA降低了ETEC感染下IL-7的表達(dá)[40]（圖2）。

腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)感受體作為氨基酸營養(yǎng)信號傳導(dǎo)的重要環(huán)節(jié)，對腸道功能維持發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)運(yùn)感受體感應(yīng)胞外的刺激及激活胞內(nèi)信號, 影響腸道上皮細(xì)胞的增殖分化與功能[54]，還與腸道防御機(jī)制相關(guān)。其中鈣敏感受體CaSR在維持和恢復(fù)腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，激活CaSR可以刺激腸黏膜屏障再生[55]。芳香族氨基酸包括L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸作為CaSR的變構(gòu)激動劑，通過激活CaSR信號通路緩解LPS誘導(dǎo)的仔豬腸道炎癥反應(yīng)[56]（圖4）。在腸細(xì)胞中芳香族L-色氨酸能夠通過激活CaSR信號通路募集β抑制蛋白2抑制NF-κB信號通路，阻斷炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮抗炎的作用[57]。

圖4 色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸（TPT）調(diào)控腸道炎癥反應(yīng)的機(jī)制Fig. 4 The mechanisms of tryptophan, phenylalanine and tyrosine (TPT) regulating intestinal inflammatory response

4 展望

腸道氨基酸的代謝對腸道發(fā)育和健康調(diào)控具有重要意義。腸道氨基酸的利用過程涉及胃腸道對蛋白質(zhì)的消化、腸道及其微生物對蛋白質(zhì)/氨基酸的代謝利用等環(huán)節(jié)，需要進(jìn)一步深入研究神經(jīng)內(nèi)分泌對上述生理過程的調(diào)控。采用整合生理學(xué)方法研究腸道—肝臟—肌肉等多器官的協(xié)同代謝網(wǎng)絡(luò)，以及神經(jīng)內(nèi)分泌對代謝網(wǎng)絡(luò)的整合調(diào)控機(jī)制；將微生物與宿主作為一個(gè)整體開展研究，在腸道及其微生物互作影響蛋白質(zhì)/氨基酸利用方面取得理論突破。此外，深入研究氨基酸感應(yīng)信號途徑，鑒定新的分子調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，為腸道代謝紊亂等營養(yǎng)代謝失衡疾病的調(diào)控提供依據(jù)。靶向開發(fā)營養(yǎng)調(diào)控劑，研究其對仔豬腸道發(fā)育和健康的調(diào)控機(jī)制，為提高仔豬生產(chǎn)力提供新方法和技術(shù)。