雷公藤甲素對大鼠坐骨神經(jīng)冷保存后細(xì)胞活性及異體移植后神經(jīng)再生的影響

汪一，黃英如，張松，李子健，曾歡歡，冼華

重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400016

目的 探討雷公藤甲素(T10)對冷保存大鼠坐骨神經(jīng)生物活性和異體移植后神經(jīng)再生的影響。

方法 取對數(shù)生長期施萬細(xì)胞(SCs)，CCK-8檢測1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L T10溶液對SCs增殖的影響。取Sprague-Dawley大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)15 mm，分別在含0 mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L T10的DMEM液中，4℃或37℃ 放置24 h(n=6)，Western blotting檢測神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)。另取大鼠坐骨神經(jīng)15 mm，隨機(jī)分成新鮮神經(jīng)組(A組,n=30)、DMEM保存組(B組,n=30)、T10保存組(C組,n=30)、T10預(yù)處理后DMEM保存組(D組,n=30)、T10預(yù)處理后T10保存組(E組,n=30)，4℃保存4周，Calcein-AM/PI雙染激光共聚焦顯微鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)活細(xì)胞、死細(xì)胞數(shù)，Western blotting檢測主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ(MHC-Ⅰ)、MHC-Ⅱ、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)。用上述坐骨神經(jīng)修復(fù)Wistar大鼠坐骨神經(jīng)10 mm缺損(A′組、B′組、C′組、D′組、E′組,n=10)，設(shè)立同系移植新鮮組(F′組,n=10)。術(shù)后16周，電生理檢測肌肉復(fù)合動作電位(CMAP)和運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)；取移植段神經(jīng)，觀察神經(jīng)纖維數(shù)和神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)。

結(jié)果 SCs在濃度為1×10-9～1×10-7mol/L T10溶液下，細(xì)胞增殖與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。各濃度T10溶液下，大鼠坐骨神經(jīng)各神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)均37℃明顯高于4℃；相同溫度時，1×10-8mol/L組各神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)均高于其他濃度組(P＜0.05)。大鼠坐骨神經(jīng)冷保存4周后，與B、C、D組相比，E組神經(jīng)活細(xì)胞數(shù)量多，MHC-I、MHC-II、ICAM-1表達(dá)降低(P＜0.05)。移植術(shù)后16周，E′組CMAP、MNCV、再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量均優(yōu)于A′、B′、C′、D′組(P＜0.05)，E′、F′組有髓神經(jīng)纖維數(shù)量多，粗細(xì)均勻，分布廣泛，髓鞘厚。

結(jié)論 一定濃度T10體外能誘導(dǎo)大鼠坐骨神經(jīng)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，提高冷保存神經(jīng)生物活性，降低免疫原性，促進(jìn)異體移植后受體神經(jīng)再生；冷保存前用一定濃度T10預(yù)處理效果更好。

自體神經(jīng)移植作為周圍神經(jīng)缺損，尤其是長段神經(jīng)缺損的主要治療手段，因來源有限和造成新的神經(jīng)缺損等隱患，制約了其臨床應(yīng)用。同種異體神經(jīng)具有與自體神經(jīng)相同的組織結(jié)構(gòu)，可能是自體神經(jīng)最好的替代物[1-2]。實(shí)現(xiàn)同種異體神經(jīng)的臨床化應(yīng)用，成功的體外保存是基礎(chǔ)。周圍神經(jīng)的體外保存面臨缺血、缺氧和低溫環(huán)境，會造成組織細(xì)胞損傷，導(dǎo)致周圍神經(jīng)的施萬細(xì)胞(Schwann cells,SCs)失去活性甚至死亡；而SCs是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和黏附分子，對神經(jīng)損傷后軸突再生極為重要[3-4]。維持SCs的生物活性是周圍神經(jīng)體外保存的關(guān)鍵。

雷公藤甲素(triptolide,T10)是我國傳統(tǒng)中藥雷公藤的主要藥理活性成分之一，具有抗炎和免疫抑制等作用[5-6]。T10可保護(hù)PC12細(xì)胞免受氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷和凋亡，具有保護(hù)神經(jīng)元、改善神經(jīng)功能的作用[7-9]；還能促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子[10]。本研究觀察T10對低溫保存大鼠坐骨神經(jīng)生物活性和異體移植后受體神經(jīng)再生的影響，以提高周圍神經(jīng)低溫保存的成功率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動物

大鼠SCs株(RSC96細(xì)胞株)：中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，目錄號GNR 6。

SPF級雌性Sprague-Dawley大鼠300只，體質(zhì)量(200±20)g，重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(渝)2012-0001。Wistar雌性大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2015-030。動物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理實(shí)施細(xì)則》的要求，依照動物福利與倫理原則處理。12 h明暗交替，相對濕度65%～75%，室溫22～24℃。

1.2 試劑與儀器

T10：上海Aladdin公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMSO、0.25%胰酶、Ⅱ型膠原酶、低糖型DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基：美國HYCLONE公司。RPMI1640培養(yǎng)基：美國GIBCO公司。青霉素-鏈霉素雙抗：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ(major histocompatibility complex-Ⅰ,MHC-Ⅰ)、MHC-Ⅱ、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)單克隆抗體：美國SANTACRUZ公司。β-actin：武漢中杉金橋生物技術(shù)有限公司。山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。CCK-8：日本DOJINDO公司。tritonX-100：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。Calcein-AM：日本東仁化學(xué)科技有限公司。碘化丙啶(propidium iodide,PI)：上海前塵生物科技有限公司。FITC-Annexin V凋亡檢測試劑盒Ⅰ：美國BD BIOSCIENCES公司。蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所。

EPICS-XL型流式細(xì)胞儀：美國BECKMANCOULTER公司。LEICA TCS SP2激光掃描共聚焦顯微鏡：德國LEICA公司。蛋白質(zhì)垂直電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、圖像分析軟件：美國BIO-RAD公司。VICTOR3酶標(biāo)儀、Geliance 200凝膠成像系統(tǒng)：美國PERKENELMER公司。低溫高速離心機(jī)：德國SIGMA公司。H-7500透射電鏡：日本HITACHI公司。

1.3 方法

1.3.1 T10冷保存大鼠坐骨神經(jīng)的適宜濃度

1.3.1.1 對SCs毒性

取處于對數(shù)生長期SCs，0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，半徑6 cm、1000 r/min離心5 min后棄上清，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×104/ml，接種于 96 孔板中，每孔 200 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。棄上清，加入含T10 1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L的DMEM溶液(含10%FBS、4%DMSO、1%青-鏈雙抗)，每孔200 μl；對照組加等量DMEM溶液，并設(shè)置加入等量蒸餾水的無細(xì)胞空白組。每組設(shè)5個復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。終止培養(yǎng)前2 h，每孔加CCK-8試劑20 μl。酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔吸光度(A)；計(jì)算各組細(xì)胞存活率：

重復(fù)3次。

1.3.1.2 坐骨神經(jīng)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌

Sprague-Dawley大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，空腹24 h，SPF動物房無菌操作臺上消毒后鋪巾，10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，于梨狀肌下緣5 mm處截取大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)各約15 mm，生理鹽水沖洗。隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠坐骨神經(jīng)浸在含T10 0 mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L的DMEM溶液中，4℃或37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)處理24 h(n=6)。Western blotting檢測NGF、GDNF和BDNF蛋白表達(dá)。

取神經(jīng)組織約30 mg，10 ml/kg加入裂解液，勻漿，靜置1 h；12000 r/min離心15 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜，加一 抗 (NGF 1∶ 1000、 GDNF 1∶ 1000、 BDNF 1∶2000、GAPDH 1∶5000)4℃孵育過夜；TBST洗膜，加山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育60 min，TBST洗膜，ECL顯色。Image J軟件處理，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與GAPDH的灰度比。生物學(xué)重復(fù)6次。

1.3.2 坐骨神經(jīng)冷保存

同法另取SPF級雌性Sprague-Dawley大鼠坐骨神經(jīng)15 mm，隨機(jī)數(shù)字表法分成5組(n=30)。A組不進(jìn)行任何處理；B組在DMEM溶液中4℃保存4周；C組在含1×10-8mol/L T10的DMEM溶液中4℃保存4周；D組在含有1×10-8mol/L T10的DMEM溶液中，37℃、5%CO2預(yù)處理24 h，然后在DMEM溶液中4℃保存4周；E組在含有1×10-8mol/L T10的DMEM溶液中，37℃、5%CO2預(yù)處理24 h，然后在含1×10-8mol/LT10的DMEM溶液中4℃保存4周。

1.3.2.1 坐骨神經(jīng)活性

取各組坐骨神經(jīng)各4條(A組檢測時取材，下同)，修剪成2 mm，浸入1%tritonX-100中通透30 min，PBS沖洗；室溫Calcein-AM 20 μmol/L孵育30 min，PBS洗滌；PI 50 mg/L染色15 min，PBS洗滌；防熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長490 nm和535 nm，活細(xì)胞呈綠色熒光，死細(xì)胞呈紅色熒光。觀察熒光強(qiáng)度。

將坐骨神經(jīng)置含10%胎牛血清的PBS中，加入Ⅱ型膠原酶，37℃振蕩1 h；置不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基的平皿中，洗滌、剪切后研碎，200目過濾，制成單個細(xì)胞懸液，4℃、半徑6 cm、1000 r/min離心5 min。細(xì)胞37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞，洗滌，根據(jù)Annexin V FITC/PI試劑盒說明染色，EPICS-XL流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.2.2 免疫原性

按照1.3.1.2方法，檢測各組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。

1.3.3 同種異體移植效果

雌性Wistar大鼠60只，10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，右股后外側(cè)縱行切口，鈍性分離，游離坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下緣5 mm處整齊切除坐骨神經(jīng)10 mm。分別取A、B、C、D和E組神經(jīng)，修剪成10 mm，手術(shù)顯微鏡下，9-0線行神經(jīng)外膜無張力間斷縫合4～6針(A′組、B′組、C′組、D′組、E′組,n=10)。逐層關(guān)閉切口。手術(shù)由同一人操作，術(shù)后不做特殊處理。

SPF級Wistar雄性大鼠5只，同法取坐骨神經(jīng)10條，修復(fù)Wistar雌性大鼠坐骨神經(jīng)10 mm缺損組(F′組,n=10)。

觀察術(shù)后大鼠精神狀態(tài)、飲食、傷口愈合、潰瘍發(fā)生情況。

1.3.3.1 神經(jīng)電生理檢測

移植術(shù)后16周，大鼠10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，原切口暴露坐骨神經(jīng)。觀察移植神經(jīng)段粗細(xì)、與周圍組織粘連情況等。刺激電極置梨狀肌下緣3 mm處神經(jīng)干，接收電極置外踝上10 mm腓腸肌中部，地線遠(yuǎn)離兩電極，刺激強(qiáng)度1 V，間歇0.25 ms。BL-420F系統(tǒng)測定肌肉復(fù)合動作電位(compound muscle action potential,CMAP)和神經(jīng)傳導(dǎo)速度(never conduction velocity,NCV)。

1.3.3.2 組織學(xué)觀察

電生理檢測后，整齊截取移植神經(jīng)中段3 mm，2.5%戊二醛4℃固定過夜，1%鋨酸固定2 h，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋。0.5 μm半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，每個樣本隨機(jī)選5張切片，每張切片隨機(jī)取5個視野，CCD光譜測量系統(tǒng)觀察，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)有髓神經(jīng)纖維數(shù)目。超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)，計(jì)算有髓神經(jīng)纖維髓鞘厚度與神經(jīng)纖維直徑的比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 T10冷保存大鼠坐骨神經(jīng)的適宜濃度

2.1.1 對SCs毒性

T10濃度為1×10-6mol/L時，SCs存活率下降(P＜0.05)。其他濃度下，SCs存活率與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 不同濃度T10下SCs存活率比較(%)

2.1.2 坐骨神經(jīng)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌

各組均可檢測出NGF、BDNF、GDNF蛋白表達(dá)。37℃預(yù)處理各組，NGF、BDNF、GDNF蛋白表達(dá)均高于4℃預(yù)處理各組(P＜0.05)。

4℃預(yù)處理時，NGF表達(dá)在1×10-8mol/L T10組最高(P ＜ 0.05)；GDNF表達(dá)1×10-8mol/L T10組、1×10-9mol/L T10組最高(P ＜0.05)；BDNF表達(dá)1×10-8mol/L T10組、1×10-9mol/LT10組最高，1×10-7mol/LT10組次之(P＜0.05)。

37℃預(yù)處理時，NGF表達(dá)在1×10-8mol/L T10組最高(P ＜ 0.05)；GDNF表達(dá)1×10-8mol/L T10組、1×10-9mol/L T10組最高，1×10-6mol/L T10組、1×10-7mol/L T10組次之(P＜0.05)；BDNF表達(dá)，1×10-7mol/L T10組、1×10-8mol/L T10組最高，1×10-9mol/L T10組次之，1×10-6mol/L T10組高于對照組(P＜0.05)。

見圖1、表2。

圖1 不同溫度、濃度T10預(yù)處理坐骨神經(jīng)各神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白表達(dá)

表2 不同溫度、濃度T10預(yù)處理坐骨神經(jīng)各神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白表達(dá)(/β-actin)

2.2 坐骨神經(jīng)冷保存

鑒于以上實(shí)驗(yàn)提示，1×10-8mol/L T10促神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌最佳，故以下實(shí)驗(yàn)均按此濃度添加T10。

2.2.1 MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1蛋白表達(dá)

與A組相比，B、C、D、E組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1蛋白表達(dá)均下降(P＜0.05)。B、C、D、E組中，MHC-Ⅰ表達(dá)，E、C組最低，D組次之，B組最高(P＜0.05)；MHC-Ⅱ、ICAM-1表達(dá)，E組最低，C組次之，D組又次之，B組最高(P＜0.05)。見圖2、表3。

2.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察

A組以綠色熒光為主，可見零星紅色熒光分布；B、C、D、E組紅色熒光強(qiáng)度較A組增加，綠色熒光強(qiáng)度減少。B、C、D、E組中，E組綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度最低，C、D組次之，B組最差。見圖3。

2.2.3 流式細(xì)胞儀檢測

A組90%以上為活細(xì)胞，B、C、D、E組活細(xì)胞百分比均較A組降低。B、C、D、E組中，E組活細(xì)胞百分比最高，C組次之，B、D組最低(P＜0.05)。見圖4、表4。

圖2 冷保存下各組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1蛋白表達(dá)

表3 冷保存下各組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1蛋白表達(dá)(/β-actin)

表4 流式細(xì)胞儀檢測各組存活率(%)

圖3 冷保存各組神經(jīng)細(xì)胞存活(免疫熒光染色,bar=50μm)

圖4 冷保存各組神經(jīng)細(xì)胞存活和凋亡的流式細(xì)胞儀檢測

2.3 同種異體移植

2.3.1 一般情況

各組大鼠術(shù)后切口均未出現(xiàn)感染，實(shí)驗(yàn)期間無大鼠死亡，無足底潰瘍、足趾脫落等損害。取材時，發(fā)現(xiàn)A′、B′、C′、D′、E′組神經(jīng)移植段與周圍組織輕度粘連，遠(yuǎn)近吻合口輕微膨大；F′組移植神經(jīng)與周圍組織無明顯粘連，遠(yuǎn)近吻合口無明顯膨大。

2.3.2 神經(jīng)電生理

移植術(shù)后16周，各組間CMAP、NCV均有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，F(xiàn)′組最高，E′組次之，再次為C′、D′組，A′、B′組最低(P ＜ 0.05)。見表5。(P＜0.05)。見圖5、表6。

表5 移植術(shù)后各組神經(jīng)電生理檢查結(jié)果

電鏡觀察，F(xiàn)′組和E′組可見大量有髓神經(jīng)纖維，纖維粗細(xì)均勻；C′組和D′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量較多，分布較廣泛；A′組和B′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量較少，分布較稀疏，可見明顯結(jié)蹄組織增生。有髓神經(jīng)纖髓鞘厚度與神經(jīng)纖維直徑的比，F(xiàn)′組＞E′組＞C′組 ＞ D′組 ＞A′組 =B′組(P ＜ 0.05)。見圖6、表6。

表6 移植術(shù)后各組再生神經(jīng)纖維情況

2.3.3 組織學(xué)觀察

各組之間有髓神經(jīng)纖維數(shù)有非常高度顯著性差異(P ＜ 0.001)，F(xiàn)′組 ＞ E′組 ＞ C′組 ＞ D′組 ＞ A′組 ＞ B′組

圖5 移植術(shù)后16周移植神經(jīng)中段(甲苯胺藍(lán)染色,bar=50μm)

圖6 移植術(shù)后16周移植神經(jīng)中段超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡,bar=10μm)

3 討論

自體神經(jīng)移植因來源受限、供區(qū)并發(fā)癥等缺點(diǎn)，不能滿足周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的需要；同種異體神經(jīng)具備相同的組織結(jié)構(gòu)，且來源豐富，可能是自體神經(jīng)最佳替代物。與器官移植一樣，有效的體外保存成為移植技術(shù)的重要限制因素。目前國內(nèi)外尚無公認(rèn)的周圍神經(jīng)體外保存方法。

T10是中藥雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎、免疫抑制作用。我們在坐骨神經(jīng)保存液中添加一定濃度T10，希望能對低溫保存的坐骨神經(jīng)發(fā)揮保護(hù)作用?？紤]到T10的毒性，我們先進(jìn)行SCs細(xì)胞毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，T10在1×10-9～1×10-7mol/L濃度下，對SCs無明顯毒性作用。

T10能促進(jìn)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子[11]，而神經(jīng)營養(yǎng)因子除了促進(jìn)神經(jīng)損傷后軸突生長和對新生軸突的導(dǎo)向作用外[12-13]，還有營養(yǎng)作用和促神經(jīng)細(xì)胞存活的作用，對周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[14-15]。本研究顯示，1×10-8mol/L T10溶液37℃預(yù)處理24 h，神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)最多；T10中冷保存4周后，經(jīng)上述T10預(yù)處理的神經(jīng)活細(xì)胞最多。推測大鼠坐骨神經(jīng)用一定濃度T10溶液預(yù)處理和保存，能對大鼠坐骨神經(jīng)起到疊加保護(hù)作用。

免疫排斥反應(yīng)是影響同種異體周圍神經(jīng)移植成功的重要因素，理想的體外保存異體神經(jīng)應(yīng)在盡量保留神經(jīng)活性細(xì)胞的前提下，降低神經(jīng)免疫原性。MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1在移植排斥反應(yīng)中起重要作用[16-17]：MHC-Ⅰ分子由CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識別，MHC-Ⅱ分子與CD4+T細(xì)胞活化、增殖密切相關(guān)，而CD8+、CD4+T細(xì)胞是介導(dǎo)同種異體排斥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞；ICAM-1在T細(xì)胞黏附、激活及侵入等環(huán)節(jié)發(fā)揮作用[18-20]。雷公藤制劑有抗排斥反應(yīng)作用[21]，在體外能抑制MHC、共刺激分子表達(dá)，削弱抗原呈遞細(xì)胞抗原呈遞功能和對T細(xì)胞的激活作用[22]。本研究顯示，大鼠坐骨神經(jīng)4℃冷保存4周后，各組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1表達(dá)均較新鮮神經(jīng)降低，可能與冷保存后SCs活性下降、凋亡增加有關(guān)；而T10冷保存能進(jìn)一步抑制神經(jīng)移植物MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和ICAM-1表達(dá)，從而降低異體移植后急性期排斥反應(yīng)。

本研究用不同方法冷保存的Sprague-Dawley大鼠坐骨神經(jīng)修復(fù)Wistar大鼠坐骨神經(jīng)缺損，術(shù)后16周觀察，T10保存、T10預(yù)處理的神經(jīng)，治療效果較佳；兩者合用效果更佳。神經(jīng)損傷后，隨著時間推移，其支配的靶肌肉將發(fā)生不可逆萎縮，失去功能，其功能恢復(fù)與神經(jīng)軸突的再生關(guān)系密切[23-24]。NCV與神經(jīng)纖維直徑相關(guān)，再生纖維傳導(dǎo)速度的恢復(fù)，很大程度上取決于髓鞘厚度的恢復(fù)，髓鞘厚度也是再生纖維成熟程度的反映[25]。本研究顯示，T10保存、T10預(yù)處理的神經(jīng)，再生效果良好。這可能由于T10對低溫保存的神經(jīng)組織具有保護(hù)作用；同時，T10預(yù)處理可通過促進(jìn)神經(jīng)組織分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，提高SCs活性；還能降低免疫原性，從而有利于異體移植后神經(jīng)軸突再生，促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，T10預(yù)處理能促進(jìn)坐骨神經(jīng)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)；經(jīng)T10預(yù)處理后的坐骨神經(jīng)，在保存液中添加T10，可提高SCs活性，降低免疫原性，從而減弱移植后排斥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)再生及功能恢復(fù)。