環(huán)磷酰胺對大鼠燒傷后早期心肌中性粒細(xì)胞的表達(dá)及心功能的影響

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嚴(yán)重?zé)齻缙谌碛行аh(huán)血量下降之前，心肌缺血缺氧損害及功能減退即已發(fā)生。魏在榮等[1]前期研究認(rèn)為使用2.0 mg/kg～2.5 mg/kg低劑量環(huán)磷酰胺(CY)無明顯細(xì)胞毒副作用，并具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，同時有研究表明低劑量CY具有保護(hù)心肌作用[2]。本研究為進(jìn)一步研究燒傷后心肌保護(hù)機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組 成年雄性清潔級SD大鼠(由第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供)100只，體重160 g～200 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)于SPF級動物實驗中心1周，體重增至210 g～270 g。隨機分為4組：CY組(n=40)、燒傷組(n=40)、CY對照組(n=10)、空白組(n=10)。

1.2 動物模型制備 將SD大鼠燒傷前禁食12 h，稱重，CY組與燒傷組按公式面積(S)(cm2)=12.5×W2/3(S為面積，W為體重)計算需燒傷的面積，于大鼠腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，麻醉成功后背部剃毛，劃出致傷面積標(biāo)志，8%硫化鈉背部脫毛，待毛被溶解成淡綠色糊狀時立刻用溫水徹底清洗干凈，3%凝固汽油涂抹于致傷范圍內(nèi)，用量約0.4 mL/10 cm2，濕布保護(hù)周圍正常皮膚，點火燃燒致傷20 s制成30%體表總面積(TBSA)Ⅲ度燒傷。燒傷模型建立后，燒傷組大鼠立即腹腔注射乳酸林格氏液(50 mL/kg)，CY組大鼠立即腹腔注射乳酸林格氏液(50 mL/kg)和CY(2 mg/kg)；空白組和CY對照組僅背部剃毛和硫化鈉脫毛，空白組大鼠于腹腔內(nèi)注射生理鹽水(50 mL/kg)，CY對照組大鼠于腹腔內(nèi)注射生理鹽水(50 mL/kg)和CY(2 mg/kg)。模型制作完成后所有大鼠自由飲食。所有實驗大鼠均進(jìn)入實驗分析，無一只意外死亡。

1.3 標(biāo)本采集及處理 CY組和燒傷組在建模成功后2 h、6 h、12 h、24 h時相點提前20 min各隨機取10只大鼠，麻醉后頸動脈插管，而后緩慢將導(dǎo)管推入左心室，將插管導(dǎo)管接入RM6240B生理信號采集處理系統(tǒng)壓力換能器通道，穩(wěn)定5 min后，記錄左心室收縮壓(LVSP)，左心室終末舒張壓(LVEDP)、左室壓最大上升速率(dp/dtmax)、左室壓最大下降速率(-dp/dtmax)、待以上步驟完成后，抽取腹主動脈血5 mL，經(jīng)抗凝分離出血清保存于-80 ℃冰箱用于檢測血清肌鈣蛋白I(cTnI)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)。取血完成后大鼠放血處死，無菌條件下采集心臟組織，生理鹽水漂洗5 min，洗去殘留血液。心臟標(biāo)本錫紙包裹后立即置入-80 ℃冰箱保存用于檢測心肌組織髓過氧化物酶(MPO)。于24 h時相點同法測定空白組與CY對照組大鼠LVSP、LVEDP、dp/dtmax、-dp/dtmax，取空白組大鼠動脈血血清及心臟標(biāo)本，取材方法同上。

1.4 主要實驗試劑 MPO試劑盒(南京建成科技有限公司)；大鼠心肌cTnI酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司)；注射用乳酸林格氏液(四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司)；CY(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；生理鹽水(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 血流動力學(xué)及心肌力學(xué)指標(biāo)監(jiān)測 按RM6240B生理信號采集處理系統(tǒng)壓力換能器使用說明讀取數(shù)據(jù)。

1.5.2 心肌組織MPO測定 參照說明書步驟操作，使用721分光光度計檢測(上海申化儀表自控公司)。取左心室心肌組織100 mg，剪碎后加入0.5%溴化十六烷基三甲基銨2 mL制備勻漿，超聲細(xì)胞粉碎儀粉碎3次，每次10 s，應(yīng)用低溫離心機4 ℃、3 000 r/min離心15 min。取上清液0.1 mL并加反應(yīng)液2.9 mL，旋渦混勻器混勻，于室溫25 ℃保存，于紫外線分光光度計460 nm處測定2 min，記錄30 s～90 s A值變化，1單位MPO活力以25 ℃每分鐘分解1 μmoL H2O2表示，按下列公式計算：MPO(μg)=ΔA460 min÷[11.3×所加組織量(g)/反應(yīng)液的量(L)]。

1.5.3 心肌cTnI測定 參照說明書操作：加入標(biāo)準(zhǔn)品、血清于反應(yīng)板中，再加入酶聯(lián)物，混勻并溫育90 min，洗板，加顯色液并溫育20 min后加入終止液，確定藍(lán)色變?yōu)辄S色時，15 min內(nèi)在450 nm處讀D(450)值。

1.5.4 血漿CK-MB測定 采用全自動生化分析儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血流動力學(xué)及心肌力學(xué)參數(shù)比較 燒傷組大鼠血流動力學(xué)及心肌力學(xué)指標(biāo)LVSP、LVEDP、dp/dtmax及-dp/dtmax從建模后2 h后開始降低，12 h達(dá)峰值，24 h開始升高，燒傷組2 h、6 h、12 h、24 h各時相點與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY組從建模后2 h后降低，6 h達(dá)到最低水平，12 h開始升高，24 h升高明顯，2 h、6 h、12 h、24 h組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY組與燒傷組比較，CY組從建模6 h開始升高，12 h升高較燒傷組明顯，2 h、6 h、12 h、24 h各時相點兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY對照組與空白組各相應(yīng)時相點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)及心肌力學(xué)參數(shù)比較(±s)

2.2 各組大鼠心肌組織MPO活性比較 燒傷組心肌組織MPO活性從建模后2 h后開始增高，6 h達(dá)峰值，12 h開始下降，24 h仍保持較高水平，2 h、6 h、12 h、24 h燒傷組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY組心肌組織MPO活性從建模后2 h增高，6 h達(dá)到較高水平，12 h開始下降，24 h下降明顯，2 h、6 h、12 h、24 h CY組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY組與燒傷組比較，CY組心肌組織MPO活性從建模后12 h開始下降，24 h下降明顯，2 h、6 h、12 h、24 h各時相點兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY對照組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心肌組織MPO活性比較(±s) μg/mL

2.3 各組大鼠血清cTnI含量比較 燒傷組大鼠血清cTnI含量從建模后2 h后開始增高，12 h達(dá)峰值，24 h開始下降，2 h、6 h、12 h、24 h燒傷組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY組從建模后2 h增高，12 h達(dá)到較高水平，24 h下降明顯，2 h、6 h、12 h、24 h CY組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY組與燒傷組比較，CY組大鼠血清cTnI含量從建模后12 h開始下降，24 h下降明顯，2 h、6 h、12 h、24 h各時相點兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血清cTnI含量比較(±s) ng/mL

2.4 各組大鼠血清CK-MB含量比較 燒傷組大鼠血清CK-MB含量從建模2 h后開始增高，12 h達(dá)峰值，24 h開始下降，2 h、6 h、12 h、24 h燒傷組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY組從建模后2 h增高，12 h達(dá)到較高水平，24 h下降明顯，2 h、6 h、12 h、24 h CY組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY組與燒傷組比較，CY組大鼠血清CK-MB含量從建模后12 h開始下降，24 h下降明顯，2 h、6 h、12 h、24 h各時相點兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CY對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠血清CK-MB含量比較(±s) U/L

3 討 論

糖皮質(zhì)激素類及非甾體類抗炎藥物通過或部分通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活化達(dá)到抗炎目的，但這兩類藥物作用廣泛，劑量要求較大，較高濃度時才能起到抑制NF-κB作用，其毒副作用對機體損傷較大[3]。國內(nèi)外學(xué)者對大劑量糖皮質(zhì)激素使用持有爭論，王達(dá)利等[4]動物實驗證實低劑量CY能減少炎癥介質(zhì)釋放，血漿及各臟器內(nèi)腫瘤壞死因子-α顯著減少，并能延長實驗動物的生存時間。有實驗證實，低劑量CY可減輕心肌中性粒細(xì)胞浸潤[2]。本實驗CY對照組大鼠血流動力學(xué)、心肌力學(xué)參數(shù)、心肌組織MPO活性、CK-MB含量及血清cTnI含量與相應(yīng)時相點空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，該結(jié)果進(jìn)一步表明低劑量CY對大鼠心肌細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用。

嚴(yán)重創(chuàng)傷發(fā)生時，中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞嗜天青顆粒釋放MPO等過氧化物酶類，MPO活性反映多形核白細(xì)胞(PMN)的浸潤數(shù)量，是評價炎癥反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[5]。嚴(yán)重創(chuàng)傷后機體內(nèi)巨噬細(xì)胞(Mφ)凋亡逐漸增加，凋亡PMN被Mφ吞噬數(shù)量減少，PMN發(fā)生繼發(fā)性壞死，細(xì)胞內(nèi)容物釋放MPO、氧自由基等炎性細(xì)胞因子，釋放到心肌細(xì)胞外的MPO，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和氧化性心肌組織損傷[6]。本實驗結(jié)果可見燒傷組大鼠心肌組織中MPO值明顯增高，說明心肌組織PMN釋放增多，證實心肌細(xì)胞損傷加重，心肌細(xì)胞損傷直接導(dǎo)致心功能降低。心肌cTnI和CK-MB為評價心肌損傷的指標(biāo)，其血漿含量的變化與心肌的損傷程度呈平行關(guān)系[7]，其中分子量為2.4×104的cTnI是心肌特有，心肌細(xì)胞因缺血、缺氧等發(fā)生變性壞死時，cTnI通過破損細(xì)胞膜釋放入血。cTnI分子量較小并持續(xù)從變性細(xì)胞內(nèi)逸出，目前可視為判斷心肌損傷特異和敏感指標(biāo)[8]；CK-MB敏感性較強，但由于骨骼肌含有少量CK-MB，重度燒傷常伴有肌肉損傷，故其特異性稍差。本研究燒傷組和CY組血漿cTnI及CK-MB含量2 h后開始增高，12 h達(dá)峰值，進(jìn)一步佐證心肌功能的損傷。CY組各相應(yīng)時相點大鼠的心肌組織MPO含量較燒傷組顯著降低，同時CY組大鼠血清cTnI及CK-MB含量較燒傷組明顯降低。大鼠血漿cTnI及CK-MB含量變化與大鼠心肌組織中MPO含量呈平行關(guān)系，證實低劑量CY可有效減輕心肌組織的炎癥反應(yīng)，保護(hù)心功能。

經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)心肌損傷在嚴(yán)重?zé)齻缙诩匆殉霈F(xiàn)，由于燒傷局部和其他部位血管通透性增加，血漿大量滲出至第三間隙，造成有效循環(huán)量銳減，心肌由于灌注不足引起缺血缺氧、炎癥損傷等導(dǎo)致心臟產(chǎn)生一系列相互關(guān)聯(lián)的反應(yīng)，最終加重休克致死亡[9]。心肌力學(xué)是應(yīng)用心肌張力、長度和收縮、延長速度等力學(xué)特性為參數(shù)表達(dá)心肌舒張及收縮性能[10]。本實驗結(jié)果顯示，燒傷組大鼠燒傷后2 h開始LVSP、LVEDP、dp/dtmax及-dp/dtmax均明顯降低，12 h達(dá)峰值，提示嚴(yán)重?zé)齻缙诩创嬖谛募∈湛s舒張功能下降，且舒張功能下降的發(fā)生時間早于收縮功能發(fā)生障礙時間[11]。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)CY組大鼠燒傷后LVSP、LVEDP、dp/dtmax及-dp/dtmax均較燒傷組明顯降低。推測是由于低劑量CY減輕心肌組織PMN浸潤，減輕心肌炎癥反應(yīng)，降低心肌缺血缺氧損害，進(jìn)而起到保護(hù)心肌細(xì)胞，增強心功能的作用。

綜上所述，低劑量CY能顯著增加嚴(yán)重?zé)齻笫笮呐K的血流量，增強心肌收縮和舒張功能，抑制心肌細(xì)胞MPO釋放，降低燒傷血漿中cTnI及CK-MB含量，具有明顯的心肌保護(hù)作用，但其確切機制有待進(jìn)一步實驗研究。