高危型人乳頭瘤狀病毒基因分型與宮頸病變的相關(guān)性分析

杜利君 邢晏張兵 李欣趙佳杜娟 杜靜

( 1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科， 四川 南充 63700; 2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 南充 637000)

宮頸癌是全球女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。我國(guó)每年宮頸癌新發(fā)病例約13萬(wàn)，占全球新發(fā)病例總數(shù)約1/4，且逐漸年輕化，給社會(huì)和家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。迄今為止，大量研究已證實(shí)hrHPV的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的首要病因[3-4]。從慢性持續(xù)性hrHPV感染到最后進(jìn)展為惡性腫瘤常需要10～20年的時(shí)間，在此期間，及時(shí)發(fā)現(xiàn)、盡早采取有效的措施可以阻斷宮頸癌前病變的發(fā)展，對(duì)宮頸癌的篩查及預(yù)防尤為重要[5]。眾多研究顯示，hrHPV的感染率、感染的主要型別、以及感染高發(fā)年齡段，均存在著明顯的地域差異[6]。目前關(guān)于南充地區(qū)人群hrHPV感染的相關(guān)研究較少。因此，本文通過(guò)回顧分析南充地區(qū)經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為宮頸疾病的334例患者的hrHPV-DNA基因分型結(jié)果，探討hrHPV與宮頸病變的關(guān)系，為臨床婦產(chǎn)科醫(yī)師鎖定高患病女性人群提供參考，并加強(qiáng)對(duì)感染高致病性HPV患者的追蹤和隨訪提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年7月～2017年3月在南充市中心醫(yī)院、川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)宮頸病理組織學(xué)檢查確診為宮頸疾病且行hrHPV-DNA檢測(cè)的334例患者為研究對(duì)象，其中宮頸炎組162例，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變CIN I組30例，CIN II組26例，CIN III組50例，宮頸癌組66例。患者年齡21～74歲，平均(46.1±8.64)歲。排除患免疫系統(tǒng)疾病、慢性消耗性疾病、其它腫瘤疾病及行器官移植術(shù)患者。

1.2 儀器與試劑 hrHPV-DNA檢測(cè)試劑盒(上海之江生物科技股份公司)，SLAN-96P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(上海宏石公司)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本采集與處理 采樣前3d內(nèi)嚴(yán)禁陰道用藥或沖洗，避免經(jīng)期采樣和涂抹醋酸/碘液。充分暴露宮頸口，擦凈宮頸口分泌物，將宮頸刷伸入宮頸口約1cm，旋轉(zhuǎn)3圈后取出、折斷并將其置于專用細(xì)胞保存液中，4℃保存。

1.3.2 DNA提取 取混勻后的標(biāo)本1ml至離心管，12000r/min離心5min，棄上清；加入滅菌生理鹽水1ml，振蕩混勻，離心后棄上清；加入核酸提取液100ul，充分混勻，100℃金屬浴10min，離心后所得上清液即為DNA模板。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增 將PCR反應(yīng)液按要求與Taq酶混勻后瞬時(shí)離心，分別取DNA模板和陰性、陽(yáng)性對(duì)照4μl，加入至已分裝36μl/管的反應(yīng)試劑內(nèi)，蓋緊管蓋，瞬時(shí)離心后上機(jī)檢測(cè)。擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為94℃→2 min，93℃ 10s→62℃ 31s，40個(gè)循環(huán)；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在62℃。

1.3.4 結(jié)果判斷 按說(shuō)明書(shū)判斷結(jié)果，檢測(cè)15種hrHPV-DNA (16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、66、82)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(n)或百分率(%)描述，不同組間發(fā)生率的顯著性檢驗(yàn)采用2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸病變患者h(yuǎn)rHPV感染情況 宮頸病變患者h(yuǎn)rHPV檢出率為53.9% 。其中CIN II組、CIN III組、宮頸癌組hrHPV感染率顯著高于宮頸炎組和CIN I組，各級(jí)別病變中hrHPV感染率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (2=163.3,P<0.01)。隨著宮頸病變嚴(yán)重程度增加，hrHPV感染率明顯升高(趨勢(shì)性2=148.2,P<0.01) ，見(jiàn)表1。

表1 宮頸病變患者h(yuǎn)rHPV感染情況(n,×10-2) Table 1 hrHPV infection in different cervical diseases

注：與宮頸炎組和CINⅠ組比較，①P<0.01

2.2 宮頸疾病患者h(yuǎn)rHPV單一感染和多重感染情況 在180例HPV感染患者中，多重感染率為32.2% (58/180例)，單一感染率為67. 8% (122/180例)；其中宮頸炎組、CIN組、宮頸癌組HPV多重感染率分別為63.2%、25.4%和21.9%，單一感染率分別為36.8%、74.6%和78.1% ，見(jiàn)表2。CIN組、宮頸癌組的單一感染率明顯高于宮頸炎組，二重感染率低于宮頸炎組，各級(jí)別病變中hrHPV單一感染率(2=21.4,P<0.01)、二重感染率 (2=26.5,P<0.01)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三重、四重、五重感染率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，未檢出六重及以上多重感染。

2.3 宮頸病變患者h(yuǎn)rHPV前5位亞型感染情況 在HPV感染患者中，HPV-DNA亞型陽(yáng)性共檢出272次(HPV多重感染者的亞型重復(fù)計(jì)數(shù))14種亞型，未檢出45亞型。檢出率由高到低前5位型別為16型(30.9%)、58型(15.4%)、52型(11.8%)、18型(8.1%)和33型(5.1%)，提示前5位的hrHPV16、58、52、18、33各型別感染率存在差異(2=90.1,P<0.01)；此外，CIN組、宮頸癌組的16、18型感染率明顯高于宮頸炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，見(jiàn)表3。

2.4 宮頸病變患者不同年齡組HPV感染情況 在宮頸病變患者中，30～40、41～50和>50歲年齡段的hrHPV感染率顯著高于<30歲組的感染率，不同年齡段感染率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=16.8，P<0.01)，見(jiàn)表4。30～40和>50歲年齡段HPV感染率處在兩個(gè)高峰，呈現(xiàn)“U”字型特點(diǎn)，而41～50歲年齡段有一定程度降低；在不同年齡段CIN組、宮頸癌組患者h(yuǎn)rHPV的感染率均高于宮頸炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5、圖1。

表2 宮頸病變患者h(yuǎn)rHPV單一感染和多重感染情況(n,×10-2) Table 2 Simple and multiple infection in patients with cervical lesions

注：與CIN組和宮頸癌組比較，①P<0.05

表3 宮頸病變患者h(yuǎn)rHPV感染前5位亞型分布情況(n,×10-2)Table 3 Top five subtypes of hrHPV infection in patients with cervical lesions

注： HPV多重感染陽(yáng)性者重復(fù)計(jì)數(shù)，“其它”包括31、35、39、45、51、56、59、68、66、82型別。與58、52、18、33型比較，①P<0.01；與CIN組、宮頸癌組比較，②P<0.01

表4 宮頸病變患者不同年齡段hrHPV感染情況(n,×10-2)Table 4 hrHPV infection results in different ages of cervical lesions

注：與>30歲組比較，①P<0.05

3 討論

hrHPV持續(xù)感染是引起宮頸癌及其癌前病變的主要病因[4]。目前西部地區(qū)，HPV基因型檢測(cè)是發(fā)現(xiàn)hrHPV持續(xù)感染和預(yù)防宮頸病變進(jìn)展有關(guān)的最重要的決定性因素[7]。

本研究中334例宮頸病變患者，均來(lái)自于南充地區(qū)僅有的兩所三甲醫(yī)院，具有較強(qiáng)的均衡性和代表性，能夠較好地反映南充地區(qū)HPV亞型在不同級(jí)別宮頸病變中的感染情況。本研究結(jié)果顯示，hrHPV-DNA陽(yáng)性總檢出率為53.9%。其中宮頸CIN II及以上病變hrHPV的感染率明顯高于宮頸炎和CIN I，說(shuō)明隨著宮頸病變嚴(yán)重程度增加，HPV感染率明顯升高，提示hrHPV的感染在癌前病變及宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中，具有十分重要的作用[8]。有關(guān)hrHPV多重感染與宮頸病變程度的關(guān)系一直存在爭(zhēng)議，因此本文對(duì)不同級(jí)別宮頸病變程度與hrHPV多重感染進(jìn)行了分析。本研究顯示，隨著宮頸病變嚴(yán)重程度增加，HPV單一感染比例逐漸升高，多重感染比例逐漸下降，說(shuō)明宮頸癌可能是以HPV單一感染為主的致癌模式，而多重感染可能不是加快宮頸病變進(jìn)展的主要因素，這與Miranda[9]等、馮余寬[10]等的研究結(jié)果一致。雖然本研究未發(fā)現(xiàn)不同級(jí)別的宮頸病變患者HPV三重及三重以上感染存在差異(P>0.05)，但考慮到hrHPV三重以上感染病例數(shù)量較少，仍需加大樣本量進(jìn)一步研究。

表5 不同年齡段的宮頸炎、CIN、宮頸癌患者h(yuǎn)rHPV感染情況(n)Table 5 hrHPV infection results in different ages of cervical lesions

圖1 不同年齡段宮頸病變患者h(yuǎn)rHPV感染情況Figure 1 hrHPV infection results in different ages

大量流行病學(xué)研究表明，HPV感染的基因型分布存在地區(qū)差異[6]。本次研究中我們發(fā)現(xiàn)在南充地區(qū)不同級(jí)別宮頸病變患者HPV感染的主要高危型型別包括HPV 16、58、52、18、33型，與我國(guó)廣泛流行的hrHPV主要型別一致[11-12]。通過(guò)對(duì)hrHPV主要型別的檢測(cè)，有望為HPV多價(jià)疫苗的生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)，亦可為該地區(qū)針對(duì)性選擇HPV多價(jià)疫苗提供一定程度的指導(dǎo)[13]，為宮頸癌的預(yù)防提供幫助。此外，宮頸疾病患者的16型感染率明顯高于58、52、18、33型感染率(P<0.05)；CIN組、宮頸癌組的16、18型感染率明顯高于宮頸炎組(P<0.05)。結(jié)果提示，HPV 16、18型是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的最主要型別，宮頸病變的進(jìn)展可能與HPV 16、18型病毒感染有著直接關(guān)系[14]。宮頸癌組織中HPV 16、18型的E6、E7在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，HPV感染的細(xì)胞在 E6、E7的作用下無(wú)限增殖，并逐漸向惡性方向發(fā)展[15]。此外，李淑芹等[16]人通過(guò)西多福韋對(duì)HPV18陽(yáng)性的人宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡研究發(fā)現(xiàn)，E6可通過(guò)E6-AP與野生型p53蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定的E6-p53復(fù)合物，促進(jìn)p53蛋白降解，從而使細(xì)胞無(wú)限增殖，阻滯細(xì)胞凋亡。雖然本研究雖未發(fā)現(xiàn)廣泛流行的HPV58、52、33型在不同級(jí)別宮頸病變中的分布差異，但考慮到宮頸疾病患者HPV58、52、33型感染率較高，仍需引起足夠重視。

HPV感染具有明顯的年齡分布特點(diǎn)，但由于地域、文化程度、檢測(cè)方法、納入排除標(biāo)準(zhǔn)、年齡段劃分等存在差異，各地區(qū)hrHPV感染年齡段不盡相同。本研究結(jié)果顯示，在宮頸病變患者中，30～40、41～50和>50歲年齡段的hrHPV感染率分別為65.4%、45.3%和67.6%，顯著高于<30歲的33.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明30歲以上年齡段hrHPV感染率較高，且感染率呈現(xiàn)“U字型”變化特點(diǎn)[17-18]，提示30～40歲年齡段可能與其處于性活躍期、多性伴侶、吸煙或長(zhǎng)期使用口服避孕藥，以及多次人工流產(chǎn)或孕產(chǎn)史等因素有關(guān)[19]；而41～50歲段可能與患者的認(rèn)知和重視程度有關(guān)，但其具體機(jī)制仍不十分清楚；且>50歲年齡段機(jī)體免疫力和抵抗力降低，不能自行清除HPV，將增加臨床及病理改變的概率，更有可能導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[20]。因此，對(duì)于>30歲年齡段的女性感染了高致病性的HPV，應(yīng)引起婦產(chǎn)科醫(yī)師的高度關(guān)注和重視。

4 結(jié)論

HPV的持續(xù)感染在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。隨著宮頸疾病嚴(yán)重程度的增加，HPV感染率明顯增加。宮頸癌可能是以HPV單一感染為主的致癌模式，而多重感染可能不是加快宮頸病變進(jìn)展的主要因素。對(duì)于伴有持續(xù)性高致癌型別如16、58、52、18型HPV感染的30歲以上高發(fā)年齡段女性，要高度重視，做好定期隨訪；并結(jié)合細(xì)胞學(xué)和陰道鏡檢查及組織活檢來(lái)判斷有無(wú)癌前病變是預(yù)防宮頸癌的重要步驟。此外，由于各地區(qū)hrHPV感染存在一定的差異，因此掌握南充地區(qū)HPV感染率、主要基因型別、年齡特點(diǎn)，將有助于我們精準(zhǔn)識(shí)別、合理處理南充地區(qū)CIN II及以上高風(fēng)險(xiǎn)人群，對(duì)我國(guó)宮頸癌的防治、疫苗的研發(fā)都具有十分重要的意義。