對(duì)白木香種子黃酮類提取物體外抗氧化能力的研究

邵素珍

摘要：目的 分析體外條件下，白木香種子在抗氧化方面的能力。方法 對(duì)白木香的種子進(jìn)行預(yù)處理，并從中提取出黃酮類成分，并采取銅離子還原法來對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，并同抗壞血酸（即VC）來對(duì)照。測(cè)定后計(jì)算它的相對(duì)總清除率或還原百分率，將相對(duì)總清除率或者還原百分率作為縱坐標(biāo)，將樣品液濃度作為圖的橫坐標(biāo)來作線性回歸。并通過回歸曲線置信限制，計(jì)算其半抑制濃度。結(jié)果 在本研究中所得到的數(shù)據(jù)，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析后，得出白木香種子黃酮類提取物對(duì)銅離子的還原力的IC50為0.09815 mg/mL。在該考察的總體范圍當(dāng)中，白木香種子在抗氧化能力方面盡管弱于VC的抗氧化能力，但其卻隨著濃度的升高而增強(qiáng)。結(jié)論 中藥白木香種子具備較強(qiáng)抗氧化能力，可以給中藥制劑以及保健品的進(jìn)一步開發(fā)提供參考依據(jù)，其藥用價(jià)值需更進(jìn)一步的研究。

關(guān)鍵詞：白木香種子;體外抗氧化;銅離子還原

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2018）08-0073-03

所謂白木香種子，即白木香之附屬產(chǎn)物，其盡管具有很高的藥用價(jià)值，不過其真正的資源卻未能被人展開有效的開發(fā)和利用。隨著人類各項(xiàng)組織損傷等疾病均同人體內(nèi)部氧化反應(yīng)有著很大的關(guān)聯(lián)，所以，當(dāng)下已然有越來越多的學(xué)者參與到對(duì)抗氧化藥物的研究中來。不過，人們對(duì)于白木香種子體外抗氧化能力的研究卻較為稀少，有限的研究也僅局限在DPPH法，從而極大的限制了人們對(duì)白木香種子抗氧化能力的了解和認(rèn)識(shí)[1]。為了將白木香種子抗氧化的能力進(jìn)行細(xì)致的分析，在本文中，筆者將使用對(duì)銅離子的還原能力測(cè)定這一體外抗氧化方法來對(duì)白木香種子的抗氧化能力及抗菌能力進(jìn)行研究，以期對(duì)白木香種子的開發(fā)和利用帶來一定的啟發(fā)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 白木香種子（茂名市君元沉香種植發(fā)展有限公司提供）;蘆?。╮utin）標(biāo)準(zhǔn)品（北京化學(xué)試劑有限公司），鄰苯三酚，F(xiàn)eSO·7H2O;新亞銅：天津市福晨化學(xué)試劑廠;鹽酸，過氧化氫，無水乙醇，Tris，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，乙醚等試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 紫外分光光度計(jì)（UV-910O，北京瑞利公司），250 mL索氏提取器：鄭州興華玻璃儀器廠電子天平（sartorius BS 110S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），電熱恒溫水浴鍋（DK-98—1型，天津泰斯特儀器有限公司），高速萬能粉碎機(jī)（Fw80型，天津泰斯特儀器有限公司）

1.2 方法

1.2.1 提取黃酮類成分 選取1000 g成熟飽滿的白木香種子，并將其放于60度左右的干燥箱中，烘干4 h后，加以研磨至能過60目。稱取200 g的白木香種子粉末，采用無水乙醚為抽提液，80攝氏度條件下，以索氏抽提法將其脫脂及除脂溶性色素。抽提液變?yōu)闆]有顏色時(shí)，將石油醚揮盡后在用正丁醇、乙酸乙酯溶液重復(fù)前過程。最后，使用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇浸提，并回流3次提取黃酮類成分[2]。所有浸提料液的比例為1∶5，每次浸提的時(shí)間為2 h，溫度是100度，浸提6次至提取液沒有顏色為止。將所得浸提液合并之后實(shí)施減壓濃縮到恒溫后獲取浸膏。

1.2.2 黃酮類成分樣品濃度測(cè)定。

1.2.2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在120 ℃干燥至恒重后稱取10 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度是100 g/mL的蘆丁溶液。然后將其用70%乙醇進(jìn)一步稀釋成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL，各取1 mL于試管中，加70%乙醇1 mL，加NaNO2溶液（5%）0.3 mL，搖勻后靜置10 min，然后加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置10 min，再加4%的NaOH溶液2 mL，搖勻后靜置15 min后，510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，以吸光值（A，510 nm）為縱坐標(biāo)（y為吸光度），濃度（C，g/mL）為橫坐標(biāo)（x為白木香種子黃酮類化合物樣品濃度（μg/mL），進(jìn)行線性回歸并求回歸方程。

1.2.2.2 白木香種子黃酮類化合物樣品含量的測(cè)定 分別吸取1 mL樣品于10 mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度。分別取1 mL稀釋液于試管中，加70%乙醇1 mL，依次加入5% NaNO2 0.3 mL，混勻后靜置6 min，加10%Al（NO3）3 0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加4%NaOH溶液2 mL，搖勻后靜置10 min，同時(shí)以70%乙醇代替樣品液配制空白試劑。510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。

1.2.3 配置抗氧化研究樣品溶液 稱取10 mg浸膏，將其置于無水乙醇中，配置出1 mg/mL濃度白木香種子的樣品液。

1.2.4 測(cè)定還原能力 分別提取濃度不同的5 mL樣品液，并加入7.5 mmol/L的新亞銅試劑及0.01 mmol/L的硫酸銅溶液各1.25 mL，將其混合后再添加ph值為7.0，濃度為0.2 mL每升的NH4Ac溶液，將三樣液體混合至10 mL的體積，然后搖勻取1.0 mL。將該溶液搖勻后放置半個(gè)小時(shí)后，放置其在450 nm的波長(zhǎng)中對(duì)其吸光度的數(shù)值進(jìn)行測(cè)量[3]。在這段時(shí)間內(nèi)，溶劑作為其空白對(duì)照，而VC作為其陽性對(duì)照。相對(duì)總還原的百分率等于A減去A0再除以Amax減去A0。其中，A0是該樣品的濃度是0時(shí)的最大值，Amax是測(cè)量一次后所得吸光度值的最大數(shù)，而A則是該樣品的A450nm數(shù)值。

1.3 觀察指標(biāo)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 在本次研究中，以氧化劑被阻礙至一半的時(shí)候，還原劑（抑制劑）的濃度作為其觀察指標(biāo)。按上文中所提計(jì)算方法展開計(jì)算，以相對(duì)總還原率作為其縱坐標(biāo)，樣品液濃度作橫坐標(biāo)。若一物質(zhì)IC50低于10 mg/mL，則表示擁有抗氧化的能力[4].。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 在本研究中所收獲的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行線性回歸及統(tǒng)計(jì)分析（一致以SPSS 19.0計(jì)學(xué)軟件及Microsoft Office2010）。通過可見-紫外分光光度計(jì)，將各樣品濃度吸光值讀取出來，測(cè)量數(shù)不可以低于3次，并取各次所得數(shù)據(jù)的平均值。通過上文的計(jì)算公式計(jì)算出相對(duì)總清除率和還原率。以相對(duì)總清除率（還原率）的百分率作為其縱坐標(biāo)，以樣品液濃度作為數(shù)據(jù)的橫坐標(biāo)并作線性回歸，通過線性回歸置信限制，將氧化劑被阻礙至一半時(shí)還原劑（抑制劑）的濃度數(shù)值計(jì)算出來[5]。

2 結(jié)果

2.1 樣品濃度 根據(jù)實(shí)驗(yàn)而得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程y=0.002627x-0.01309（r=0.9992）

測(cè)得白木香種子黃酮類提取物樣品吸光度為y=180，由此可得其濃度為x=73.50μg/mL

2.2 對(duì)銅離子還原的能力 在濃度為0.02至0.12 mg/mL的范圍之內(nèi)，VC和白木香種子對(duì)銅離子還原的能力具有線性關(guān)系，通過對(duì)回歸線的擬合得到氧化劑被阻礙至一半時(shí)還原劑（抑制劑）的濃度數(shù)值分別為0.01725 mg/mL以及0.09815 mg/mL。具體見圖1及圖2。

圖1 白木香種子的銅離子還原能力

注：橫坐標(biāo)表示白木香種子的濃度（mg/mL），縱坐標(biāo)表示相對(duì)總還原百分率。

圖2 VC的銅離子的還原能力

注：橫坐標(biāo)表示VC濃度（mg/mL），縱坐標(biāo)表示相對(duì)總還原百分率。

3 討論

從結(jié)果上能夠知道，在可以檢測(cè)的范圍之內(nèi)，白木香種子在抗氧化方面是隨著本身的濃度升高而增強(qiáng)的。從上述討論得知，白木香種子對(duì)銅離子的還原能力的IC50為0.09775 mg/mL，VC對(duì)銅離子的還原能力的IC50分別為0.017 mg/mL，從中筆者可以看到，白木香種子相較于VC而言，其抗氧化的能力明顯不如，而國(guó)內(nèi)的學(xué)者認(rèn)為，如果某一種藥物的IC50值不高于10 mg/mL，則表示其具備抗氧化的能力[6]。因此筆者可以初步認(rèn)為，白木香種子具有較為顯著的抗氧化能力。據(jù)學(xué)者段周等在對(duì)白木香葉提取黃酮類化合物所實(shí)施的體外抗氧化能力的研究中，也較為明確的證明了該提取物的清除DPPH·能力[7]。而自由基其實(shí)是人類機(jī)體所維持生命各種活動(dòng)的過程中所衍生出來的某一活性分子，如果人體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基，便會(huì)致使組織器或者細(xì)胞產(chǎn)生損傷，進(jìn)而引發(fā)各類型的疾病，從而加快人體的衰老速度。而抗氧化劑因?yàn)槠渥陨淼目寡趸芰?，因此可以?duì)自由基的生成產(chǎn)生一定程度的抑制作用，甚至可以將自由基徹底的清除。

所謂白木香，其實(shí)就是沉香這味藥材的最重要來源之一。沉香，眾所周知的珍貴藥材。當(dāng)前，盡管沉香已然在廣東、海南等地開展了大規(guī)模的種植栽培，但我國(guó)的沉香需求也正在以一定速度的擴(kuò)大，因此其往往供不應(yīng)求。為了生態(tài)的平衡，尋找能有替代沉香的藥物便顯得極為重要[8]。而白木香種子因?yàn)槠漭^高的產(chǎn)量以及很實(shí)惠的價(jià)格，因此，其可以說是代替沉香的首選。在本研究中，筆者通過銅離子還原法這一體外抗氧化方法對(duì)白木香種子的抗氧化能力進(jìn)行了研究和測(cè)定，其結(jié)果表明，盡管白木香種子在還原銅離子的能力上較VC弱，可是隨著白木香種子濃度的升高，其抗氧化能力也隨之而升高，且其IC50值不高于10 mg/mL，具有較為顯著的抗氧化能力。此可以說是對(duì)白木香種子以及精油關(guān)于抗氧化能力的探究帶來的一定參考。

上述研究表明明，在抗氧化方面，白木香種子有著很高的能力，此外在筆者研究相關(guān)文獻(xiàn)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，白木香種子種含有各種營(yíng)養(yǎng)成分以及揮發(fā)油。所以，對(duì)白木香種子的研究需要專業(yè)人士作進(jìn)一步的藥理學(xué)分析研究，以期給今后的開發(fā)和利用帶來更為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2018-05-08）