I型牛皰疹病毒gE基因TaqMan探針熒光定量PCR檢測(cè)方法建立

張曉鋒，翁永剛，陳 岡，李守富，郭 海，葉結(jié)平，范紅結(jié)，陳鴻軍

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京210095；2.上海市金山區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，上海201500；3.上海市金山區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海201500；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

I型牛皰疹病毒（Bovine herpesvirus 1，BHV-1）又稱傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinortracheitis virus，IBRV），主要引起牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，造成傳染性壞死性鼻炎（即“紅鼻病”），可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能降低和免疫抑制，易引起繼發(fā)感染。BHV-1主要通過空氣、媒介物或者與病牛直接接觸而傳播，傳染性強(qiáng)，對(duì)產(chǎn)奶、繁育及使役均有較大影響[1-2]。

目前已證實(shí)gC、gE為BHV-1非病毒復(fù)制所必需的基因，是構(gòu)建缺失疫苗的缺失對(duì)象。國(guó)外很早就將包括gE缺失的單基因缺失苗、雙基因缺失苗以及三基因缺失苗應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，其中g(shù)E基因缺失苗免疫可以在早期產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在爆發(fā)早期使用可以有效的預(yù)防病毒流行。但是基因缺失疫苗的使用，迫切需要高靈敏度、高通量的檢測(cè)方法與之配套。由于皰疹病毒均含有g(shù)E基因且較為保守[3]，因此，本研究根據(jù)BHV-1 gE基因保守序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立了熒光定量PCR方法，為鑒別BHV-1野毒株和gE基因缺失疫苗株的感染提供技術(shù)手段。

有調(diào)查報(bào)告顯示上海市金山區(qū)奶牛中存在一定程度的BHV感染，并且因繼發(fā)感染引起肺炎等疾病的現(xiàn)象也較為嚴(yán)重[4]。本研究通過建立的熒光定量PCR對(duì)2015～2016年采集的500份牛鼻腔棉拭子和100份陰道棉拭子進(jìn)行檢測(cè)，明確了上海市金山區(qū)牛群IBR感染情況，在此基礎(chǔ)上可進(jìn)行針對(duì)該病的免疫預(yù)防，促進(jìn)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.2 病毒毒株牛皰疹病毒、牛副流感病毒、牛布氏桿菌、大腸桿菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供。

1.3 主要試劑與儀器TaqMan Universal PCR Master Mix購自Applied Biosystems公司；病毒核酸提取試劑盒（QIAamp viral RNA kit）購自QIAGEN公司；Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒構(gòu)建與引物設(shè)計(jì)以BHV-1 Cooper毒株的全基因組序列（GenBank登錄號(hào)：KU198480.1），選取其中特異區(qū)域序列與pUC57載體連接，構(gòu)建BHV-1的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品序列。通過BLAST比對(duì)分析，選擇保守特異區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，在1607～1704 bp處設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，qBHV-gE-1607F: 5'-GTCGCTCTGGGTTCAAA GT-3'，qBHV-gE-1704R: 5'-GCTGCTACCACGGT GTAAT-3'，qBHV-gE probe：5'-FAM -TTGG TTTAGGGACCCGCTTGAAGA-3'-BHQ1。

1.5 熒光定量PCR方法反應(yīng)體系和條件TaqMan熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μL：Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.2 μL，DNA模板2 μL，經(jīng)優(yōu)化后的上、下游定量引物（10 μmol/L）各0.4 μL，探針（10 μmol/L）0.8 μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)足20 μL。優(yōu)化后的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，并采集熒光40個(gè)循環(huán)。

1.6 敏感性試驗(yàn)將1×108copies/μL BHV gE的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其濃度為1×107～1×100copies/μL，作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，用于敏感性測(cè)試。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)以1×106和1×104copies/μL稀釋度的pUC-gE質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)是對(duì)同一模板同時(shí)進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，批間重復(fù)性試驗(yàn)是不同時(shí)間對(duì)同一模板進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，通過批內(nèi)和批間的Ct值變異系數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)偏差/重復(fù)值平均數(shù)）評(píng)估方法的重復(fù)性。

1.8 特異性試驗(yàn)采用本研究建立的BHV-1 gE TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，分別對(duì)牛副流感病毒、牛布氏桿菌、大腸桿菌cDNA或DNA進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估該方法的特異性。

1.9 臨床樣品檢測(cè)選取上海市金山區(qū)4家奶牛場(chǎng)，采集鼻腔棉拭子液500份、陰道分泌物100份，樣品信息見表1。采用PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行初檢，檢測(cè)結(jié)果呈陽性者，立即采集病牛和同群牛血樣和鼻腔棉拭子，利用real-time PCR方法進(jìn)行復(fù)檢。

表1 采集的樣品信息Table 1 Samples information

2 結(jié)果與討論

2.1 real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線將構(gòu)建的BHV gE質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋，最終濃度在1×107～1×100copies/μL時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，線性關(guān)系良好。

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果將BHV gE質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋為1×107～1×100copies/μL，以此為模板分別進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和熒光定量PCR擴(kuò)增，Ct值大于35，視為陰性。結(jié)果顯示，TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度最高可達(dá)10 copies/μL。

圖1 BHV-1 gE TaqMan熒光定量PCR動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 The dynamic curve of TaqMan real-time qPCR for detection of BHV-1 gE

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果以BHV-1 gE質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中的1×106和1×104copies/μL 2個(gè)稀釋度作為模板，對(duì)這2個(gè)稀釋度在不同時(shí)間段進(jìn)行2次重復(fù)測(cè)定，每次對(duì)同一模板同時(shí)進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定及設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，按照優(yōu)化的擴(kuò)增體系和條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。結(jié)果表明批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于1%，說明建立的BHV-1 gE熒光定量PCR方法具有較好的重復(fù)性，結(jié)果穩(wěn)定可靠（表2）。

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果通過建立的BHV-1 gE TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，分別對(duì)牛副流感病毒、牛布氏桿菌、大腸桿菌cDNA或DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，除標(biāo)準(zhǔn)品有特征性的擴(kuò)增曲線外，其他病原均沒有特征性的擴(kuò)增曲線（圖2），說明建立的熒光定量PCR與其他牛病毒細(xì)菌均無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。

表2 BHV-1 gE TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性Table 2 Repeatability of TaqMan real-time qPCR for detection of BHV-1 gE

圖2 BHV-1 gE TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性Fig.2 Speci ficity of TaqMan quantitative qPCR for detection of BHV-1 gE

2.5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果通過TaqMan熒光定量 PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在3家小型奶牛場(chǎng)（金山衛(wèi)鎮(zhèn)奶牛場(chǎng)、上海振華奶牛有限公司、上海憶南奶牛有限公司）采集的鼻腔棉拭子樣品中陽性數(shù)量均比較少（1%～1.5%），而大型養(yǎng)殖場(chǎng)（光明荷斯坦金山種奶牛場(chǎng)）的陽性率達(dá)20%（表3）。采集的陰道棉拭子中，大型養(yǎng)殖場(chǎng)的陽性率高達(dá)30%，小型奶牛場(chǎng)的陽性數(shù)量在0～5%之間，明顯低于大型養(yǎng)殖場(chǎng)。

表3 奶牛樣品中的BHV-1的TaqMan熒光定量檢測(cè)PCR

牛皰疹病毒感染在世界范圍內(nèi)廣泛存在，尤其在養(yǎng)牛業(yè)比較發(fā)達(dá)的地區(qū)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，BHV流行趨勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)重。BHV-1侵入牛體后，以潛伏感染和持續(xù)性感染為主要特點(diǎn)，病?？山K生帶毒。該病目前缺乏特效藥物，病牛死亡率較高，給養(yǎng)殖業(yè)可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，受國(guó)外BHV感染廣泛流行的影響，我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)種牛后，各地陸續(xù)報(bào)道了BHV-1抗體陽性牛檢出的情況。鑒于此病危害較為嚴(yán)重，且分布較廣，因而，對(duì)該病的發(fā)生與流行情況進(jìn)行普查工作顯得十分必要[1-2]。

因?yàn)锽HV-1可導(dǎo)致持續(xù)性感染，免疫并不能有效阻止野毒入侵和繁殖，防治本病的關(guān)鍵措施是對(duì)牛群進(jìn)行定期檢疫，控制傳染源。家畜傳染病的診斷方法有多種，如血清中和試驗(yàn)（SN）、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、ELISA以及核酸探針檢測(cè)技術(shù)等。這些方法對(duì)檢測(cè)BHV-1起到了重要作用，但同時(shí)也存在特異性不強(qiáng)，靈敏度差，耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。隨著PCR技術(shù)的快速發(fā)展，熒光定量PCR方法以周期短、特異性強(qiáng)，靈敏度高等特點(diǎn)成為病毒檢測(cè)的重點(diǎn)[3-4]。王海軍等[5]建立real-time PCR方法擴(kuò)增BHV-1保守性基因，與本方法反應(yīng)靈敏度相近，但相比較而言，本研究建立的TaqMan熒光定量PCR比較適用于gE缺失弱毒疫苗使用的感染牛群。

BHV自然感染狀態(tài)下有一定的潛伏期，一般為3～6 d。BHV可感染各個(gè)年齡和品種的牛，但6月齡以上的牛更為易感[1]。家畜感染BHV后，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要有呼吸道型、生殖道型、腦炎型、結(jié)膜炎型。參照基因組序列，本研究選取BHV-1 gE基因設(shè)計(jì)引物，通過TaqMan探針法Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3家小型奶牛場(chǎng)采集樣品的陽性數(shù)量均比較少（在0%～5%），而大型養(yǎng)殖場(chǎng)的陽性率達(dá)20%～30%（見表3）。而陰道棉拭子中，大型養(yǎng)殖場(chǎng)的陽性率高達(dá)30%，小型奶牛場(chǎng)的陽性數(shù)量在0-5%之間，明顯低于大型養(yǎng)殖場(chǎng)。這說明呼吸道型、生殖道型均存在，總體上大型奶牛場(chǎng)陽性率高于小型奶牛場(chǎng)。