中等強度有氧運動對表阿霉素致大鼠心肌損傷的保護作用

邊林莉 丁丹紅 方紅明

蒽環(huán)類藥物（anthracycline，ATC）目前廣泛用于乳腺癌化療中，臨床以阿霉素、表阿霉素（epirubicin，EPI）最為常用。ATC在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也會直接或間接損害患者的心肌細(xì)胞，進而導(dǎo)致腫瘤治療相關(guān)的心血管毒性[1-2]。ATC誘導(dǎo)的心臟毒性以心肌細(xì)胞損傷最為常見，如何減輕或消除ATC的心臟毒性是亟需解決的問題。本研究建立EPI致大鼠心肌損傷模型，探討中等強度有氧運動（moderate-intensity aerobic exercise，MIAE）對大鼠心肌損傷的保護作用，為EPI所致心肌損傷的治療提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性健康SD大鼠40只，體重（180±20）g，購自上海斯萊克有限公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002，合格證號：0302607。飲用水為二級純化水。實驗動物房使用許可證號為SYXK（浙）2015-0008。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。實驗開始前先讓大鼠在動物房環(huán)境中適應(yīng)7d。維持飼料由江蘇協(xié)同生物工程有限公司提供，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB14924.4-2001《實驗動物大小鼠配合飼料》。

1.1.2 藥品及試劑 0.9%氯化鈉溶液（山東齊都藥液有限公司，批號：3B151014124）；鹽酸 EPI注射液（輝瑞制藥有限公司，批號：N97871）；右丙亞胺（dexrazoxane，DEX）注射液（蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，批號：E1611022）；無水乙醇（成都市科龍化工試劑廠，批號：2015061501）；戊二醛（成都市科龍化工試劑廠，批號：2014011101）；B 型鈉尿肽（BNP）檢測試劑盒（武漢優(yōu)爾生物公司，cat#SEA478Ra，lot#L170718667）；心肌肌鈣蛋白（TNNI3）檢測試劑盒（武漢優(yōu)爾生物公司，cat#CEA541Ra，lot#L170718659）。

1.1.3 主要儀器 動物實驗跑臺（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司，型號：ZH-PT），共5條跑道，跑道之間用有機玻璃隔開，跑臺單道尺寸750mm×90mm×120mm，跑道后有聲、光、電刺激裝置，刺激電流0.05～4.00mA，跑速 0～40m/min。冰箱（YCD-EL259，中科美菱公司）；超低溫冰箱（DW-86L388，青島海爾公司）；輪轉(zhuǎn)式切片機（RM2235型，LEICA公司）；病理組織漂烘儀（Tec 2500型，常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司）；顯微鏡（BX43型，奧林巴斯公司）；電磁爐（C21-SDHC15K型，浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（PYXDHS500BS-Ⅱ型，上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（SpectraMax Plus 384型，MD公司）；透射電鏡（TECNA-10，荷蘭飛利浦公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠造模與分組 按隨機數(shù)字表法將40只SD大鼠分為正常對照組8只、心肌損傷組32只。（1）正常對照組按1.7ml/kg劑量尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液，1次/周，連續(xù)注射6周。（2）心肌損傷組按3mg/kg劑量尾靜脈注射EPI注射液，1次/周，連續(xù)注射6周；造模過程中有4只大鼠死亡。給藥6周后再隔1周，采用ELISA法測定兩組大鼠血清TNNI3、BNP，心肌損傷組大鼠血清TNNI3、BNP水平高于正常對照組為造模成功。再按隨機數(shù)字表法將心肌損傷組28只大鼠分為模型組、DEX組、MIAE組、DEX+MIAE組，每組7只。

1.2.2 治療方法 （1）正常對照組、模型組按3ml/kg劑量尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液，1次/周，連續(xù)注射6周。（2）DEX組按30mg/kg劑量尾靜脈注射DEX注射液，1次/周，連續(xù)注射6周。（3）MIAE組大鼠經(jīng)3d適應(yīng)性訓(xùn)練后，由專人在同一時間給予訓(xùn)練，第1周跑臺速度為15m/min，時間25min，隨后每周逐漸增加運動強度，至第6周跑臺速度為24m/min，時間30min，運動強度64%～76%VO2max；1次/d，每周訓(xùn)練 5d，連續(xù)訓(xùn)練 6周。DEX+MIAE組按30mg/kg劑量尾靜脈注射DEX注射液，1次/周；同時配合MIAE，訓(xùn)練方法與MIAE組相同；連續(xù)治療6周。

1.2.3 血清TNNI3、BNP檢測 治療6周后取大鼠安靜時尾靜脈血0.5ml，利用離心機制備血清標(biāo)本，采用ELISA法檢測各組大鼠血清TNNI3、BNP水平。

1.2.4 HE染色及電鏡觀察 治療6周后，大鼠斷頭處死，剖腹取大鼠心室心肌組織（左心室壁及室間隔結(jié)構(gòu)）放入4%甲醛溶液中固定，然后脫水、包埋、切片、HE染色，于光鏡下觀察。另?。?mm3心室組織塊，通過固定、脫水、包埋、固化、修塊、超薄切片（約120nm）、染色后，置于單孔銅網(wǎng)上，在透射電鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠基本情況 正常對照組大鼠在實驗期間精神、進食、毛發(fā)情況均良好，體重平穩(wěn)增加。心肌損傷組大鼠尾靜脈連續(xù)注射EPI注射液后，精神萎靡，毛發(fā)無光澤且出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，部分大鼠尾巴出現(xiàn)腫脹或壞死、尾尖脫落等情況；隨著時間延長，大鼠狀態(tài)越來越差，進食量減少，體重減輕，造模過程中有4只大鼠死亡。治療期間，模型組、DEX組各有1只大鼠死亡，MIAE組、DEX+MIAE組各有2只大鼠死亡。

2.2 各組大鼠治療后血清TNNI3、BNP水平比較 治療6周后各組大鼠血清TNNI3、BNP水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，正常對照組TNNI3、BNP水平低于模型組、DEX組、MIAE組、DEX+MIAE 組（均P＜0.05），DEX組、MIAE 組、DEX+MIAE組TNNI3、BNP水平均低于模型組（均P＜0.05），DEX+MIAE組TNNI3、BNP水平低于DEX組、MIAE組（均P＜0.05）；DEX 組與 MIAE 組 TNNI3、BNP水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠治療后血清TNNI3、BNP水平比較（pg/ml）

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果比較 正常對照組心肌細(xì)胞排列規(guī)則緊密。模型組心肌細(xì)胞空泡變性、

水腫，細(xì)胞間隙明顯增寬，部分心肌細(xì)胞核溶解壞死，有少量炎癥細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主。DEX+MIAE組病變程度最輕，偶可見少量中性粒細(xì)胞浸潤；DEX組次之，可見心肌細(xì)胞水腫發(fā)生，空泡及變性壞死較少；MIAE組治療效果差于DEX組，空泡變性病變較多，見圖1。

2.4 各組大鼠治療后心肌細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果比較 正常對照組心肌細(xì)胞細(xì)胞核及染色質(zhì)分布均勻，肌纖維肌絲排列致密，閏盤結(jié)構(gòu)規(guī)則清晰，線粒體脊清晰可見。模型組心肌細(xì)胞凋亡，染色質(zhì)聚集，肌絲斷裂，閏盤排列紊亂，線粒體與心肌肌絲之間有空泡。DEX組心肌細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)較MIAE組好；3個治療組中，DEX+MIAE組心肌細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)與正常對照組最為接近，見圖2。

圖1 各組大鼠治療后心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果比較[a：正常模型組，心肌細(xì)胞空泡變性、水腫（箭頭所示）；b：模型組，心肌細(xì)胞空泡變性、水腫（箭頭所示）；c：DEX組，心肌細(xì)胞空泡變性、水腫（箭頭所示）；d：MIAE組，心肌細(xì)胞空泡變性、水腫（箭頭所示）；e：DEX+MIAE組，中性粒細(xì)胞浸潤（箭頭所示）；×200]

圖2 各組大鼠治療后心肌細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果比較（a：正常模型組；b：模型組；c：DEX組；d：MIAE組；e：DEX+MIAE組；×8 300）

3 討論

使用ATC化療雖能明顯提高乳腺癌患者的治愈率及生存率，但藥物不具備靶向性，可引起多種毒性反應(yīng)，其中以心臟毒性尤為突出，且與劑量相關(guān)；同時，ATC對心臟的損傷是進行性、不可逆的，可導(dǎo)致患者心肌細(xì)胞變性、壞死，出現(xiàn)明顯的心功能不全（通常在用藥后3個月內(nèi)出現(xiàn)）[3]。DEX是目前唯一可以有效預(yù)防ATC導(dǎo)致心臟毒性的藥物，且對抗腫瘤治療無明顯影響，一般不產(chǎn)生新的毒性或增加ATC的毒性程度，因此臨床上常使用DEX來保護患者的心臟功能[4-5]。

有氧運動訓(xùn)練對心血管疾病的益處已有大量醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。2016年歐洲心臟病學(xué)會關(guān)于心力衰竭的治療指南中強烈推薦慢性心力衰竭患者進行規(guī)律的有氧運動，可降低其再住院風(fēng)險及病死率。適宜的有氧運動能促進Bcl-2、HIF-1α基因的表達，減少Bax基因表達，從而有效減少心肌細(xì)胞死亡[6]。但力竭性運動起著相反的作用，運動后患者血清丙二醛水平明顯增加、超氧化物歧化酶活性明顯降低，可引起機體內(nèi)源性氧自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，破壞機體正常功能的平衡[7]。龔彥豪等[8]發(fā)現(xiàn)有氧運動可維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及完整性，改善機體供氧能力，從而減輕氧自由基對心肌造成的損傷，對心肌具有保護作用。有文獻報道，適度的有氧運動能有效改善心肌梗死大鼠病理性心臟重塑及線粒體功能紊亂[9]；也能有效增加心力衰竭患者最大攝氧量，改善有氧運動能力[10-11]。

TNNI3是一種調(diào)節(jié)蛋白，也是心肌收縮不可或缺的蛋白，它參與心肌收縮偶聯(lián)過程中鈣的激活和調(diào)節(jié)，具有靈敏度和特異度均較高的特點，可反映心肌早期病變，對心力衰竭的診斷、病情評估、治療與預(yù)后判斷具有重要意義[12]。TNNI3可作為心肌損傷特有的監(jiān)測指標(biāo)[13]。BNP屬于內(nèi)源性肽類神經(jīng)激素，主要由心室分泌；發(fā)生充血性心力衰竭時，BNP濃度可升至極高，與心力衰竭的程度密切相關(guān)[14]。在EPI致心肌損傷大鼠模型中，筆者采用TNNI3、BNP作為心肌損傷的標(biāo)志物來評價左室功能失調(diào)情況。本研究結(jié)果顯示，使用EPI造模的大鼠血清TNNI3、BNP水平急劇升高，HE染色及電鏡結(jié)果也支持這種改變。經(jīng)6周治療后，DEX組、MIAE組、DEX+MIAE組大鼠血清TNNI3、BNP水平較模型組明顯下降，這提示DEX、MIAE、DEX+MIAE對心肌損傷均有不同程度的保護作用。以上3種干預(yù)方式比較，DEX+MIAE組大鼠血清TNNI3、BNP水平下降最為明顯，這說明DEX+MIAE對心肌的保護作用優(yōu)于DEX組、MIAE組。HE染色結(jié)果提示DEX+MIAE組的病變程度最輕，DEX組次之，MIAE組較為嚴(yán)重；電鏡檢查結(jié)果也提示DEX組心肌細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)好于MIAE組，其中DEX+MIAE組心肌細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)與正常對照組最為接近。雖然經(jīng)DEX、MIAE、DEX+MIAE干預(yù)后，大鼠血清TNNI3、BNP水平較模型組明顯下降，但與正常對照組比較仍明顯較高，可見EPI致心肌損傷大鼠經(jīng)治療干預(yù)后，仍存在不同程度的心肌損傷。

綜上所述，DEX、MIAE、DEX+MIAE 對 EPI致大鼠心肌損傷均有心肌保護作用，以DEX+MIAE最為明顯；但治療干預(yù)后，仍存在不同程度的心肌損傷。因此，在臨床上使用EPI治療乳腺癌時，醫(yī)生仍需高度重視其產(chǎn)生的心臟毒性。