苦瓜枯萎病生防木霉的篩選鑒定及其定殖的qPCR檢測

王永陽　杜佳　高克祥

摘要：為綠色防控苦瓜枯萎病，本研究從苦瓜根際土中分離出多株木霉，通過平板對峙培養(yǎng)法和盆栽防病試驗進行拮抗苦瓜枯萎病菌的木霉菌株篩選，對篩選到的菌株進行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，并運用實時熒光定量PCR技術(shù)對其在苦瓜植株及土壤中的定殖能力進行檢測。結(jié)果表明：篩選得到兩株防效較好的木霉菌株M2和MX，對苦瓜枯萎病的防治效果分別達54.63%和45.72%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定M2菌株為綠木霉（Trichoderma virens），MX菌株為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。木霉菌株M2和MX均不能在苦瓜植株中定殖，但在土壤中可以穩(wěn)定定殖。兩個木霉菌株具有應(yīng)用于苦瓜枯萎病的田間生物防治潛力。

關(guān)鍵詞：綠木霉；棘孢木霉；苦瓜枯萎?。簧锓乐?；實時熒光定量PCR

中圖分類號：S436.429：Q78 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2018）08-0110-06

Screening and Identification of Biocontrol Trichoderma to Wilt of

Bitter Gourd and Detection of Its Colonization by qPCR

Wang Yongyang， Du Jia， Gao Kexiang

（College of Plant Protection， Shandong Agricultural University/Shandong Provincial Key Laboratory for

Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests， Taian 271018， China）

Abstract In order to prevent and control the wilt of bitter gourd caused by Fusarium oxysporum， several Trichoderma strains was isolated from rhizosphere soils of bitter gourd field in this study. Trichoderma strains that had good control effects on the wilt of bitter gourd were screened by plate confrontation test and pot culture test， then the strains were conducted morphological and molecular biological identification. The colonization ability of screened strains of Trichoderma in the plants and soils of bitter gourd was detected by real-time PCR. The results showed that two Trichoderma strains M2 and MX had better control effect on wilt of bitter gourd with the control efficiency of 54.63% and 45.72%， respectively. According to the morphological and molecular biological identification， strain M2 was identified as Trichoderma virens， and strain MX was identified as Trichoderma asperellum. Strain M2 and MX could not be colonized in plants of bitter gourd， but they could be steadily colonized in soils. They could be applied in biocontrol of wilt of bitter gourd in field.

Keywords Trichoderma virens； Trichoderma asperellum； Wilt of bitter gourd； Biocontrol； Real-time fluorescence quantitative PCR

苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜?；鸵鸬囊环N重要土傳病害[1]，傳播速度快，防治十分困難，生產(chǎn)上常用的藥劑防治方法對苦瓜枯萎病的控制效果并不理想，且濫用化學(xué)藥劑還會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[2]。因此利用生防菌對苦瓜枯萎病進行生物防治很有必要。木霉菌（Trichoderma spp.）作為生產(chǎn)上廣泛使用的一種生防菌，已報道其對多種主要植物病原真菌如腐霉菌、輪枝菌、鐮刀菌、長蠕孢菌、交鏈孢菌、絲核菌、葡萄孢菌等有較好的拮抗活性[3-5]。為綠色防控苦瓜枯萎病，本研究從苦瓜根際土壤中分離純化出多株木霉菌株，采用平板對峙培養(yǎng)法和盆栽防病試驗進行拮抗苦瓜枯萎病菌的木霉菌株篩選，并對篩選到的菌株進行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，利用實時熒光定量PCR技術(shù)對其在苦瓜組織及土壤中的定殖能力進行評估，以期為深入開發(fā)該生防菌株提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物病原菌：苦瓜枯萎病菌 （Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）、蘋果霉心病菌（ Alternaria alternata）、蘋果樹腐爛病菌 （Valsa mali）、核桃炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、楊樹水泡潰瘍病菌（Botryosphaeria ribis）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黃瓜褐斑病菌 （Corynespora cassiicola）、甘薯根腐病菌（Fusarium solani）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum） 均由本實驗室分離保存；供試土樣及植物組織采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)植物保護學(xué)院試驗站；供試苦瓜品種為如玉41號，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張玉燦研究員提供。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基用于培養(yǎng)真菌；木霉選擇性培養(yǎng)基（THSM）（K2HPO4 0.90 g、MgSO4·7 H2O 0.2 g、NH4NO3 1 g、KCl 0.15 g、葡萄糖3 g、孟加拉紅0.15 g、瓊脂15 g、蒸餾水定容至1 000 mL，滅菌后，添加氯霉素0.25 g、鏈霉素0.03 g 和五氯硝基苯0.2 g）用于從土壤中分離純化木霉；馬鈴薯葡萄糖（PDB）液體培養(yǎng)基用于木霉和病原菌液體培養(yǎng)。

1.2 木霉菌株的分離純化

從蔬菜田中采集苦瓜植株及根際土，植株經(jīng)表面消毒后切成0.8 cm小段接種到PDA培養(yǎng)基上，待長出木霉菌落后挑菌絲接種到新的PDA培養(yǎng)基上進行純化；根際土采用稀釋涂布平板法：取10 g根際土加入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中于150 r/min搖床上振蕩30 min，從錐形瓶中吸取1 mL混合均勻的土壤懸濁液，用無菌水進行梯度稀釋，分別從10-3、10-4、10-5三個梯度中吸取200 μL加到THSM培養(yǎng)基平板上涂布均勻，將平板放于25℃條件下培養(yǎng)3 d，后挑取木霉單菌落轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上進行純化。

1.3 拮抗苦瓜枯萎病菌的木霉菌篩選及室內(nèi)防治效果測定

將苦瓜枯萎病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)7 d。將純化的木霉菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)72 h。分別取兩者的菌餅，兩點對峙培養(yǎng)法接種到新的PDA培養(yǎng)基上，以單獨接種苦瓜枯萎病病原菌的平板作為對照，7 d后測病原菌菌落半徑并計算抑制率。抑制率（%）=（對照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/對照組菌落半徑×100。

將平板對峙效果較好的木霉菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)至產(chǎn)孢，用無菌水沖洗收集孢子后制備成1.0×108 cfu/mL的孢子懸浮液作為生防菌劑備用。尖孢鐮刀菌等供試病原菌株菌餅接種到PDB液體培養(yǎng)基中，在180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，過濾菌絲后制備成1.0×106 cfu/mL孢懸液，按基質(zhì)∶孢懸液=10∶1的比例混勻。將苦瓜苗栽種到基質(zhì)中，同時以不同木霉生防菌劑作為處理，每株苗加20 mL制備好的相同濃度的木霉孢子懸浮液，對照組加等量無菌水，每處理31株苗。30 d后調(diào)查各處理的發(fā)病率和病情指數(shù)，計算防病效果。病害分級標(biāo)準(zhǔn)[6]：0級，無病癥；1級，子葉發(fā)黃；3級，子葉變黃且邊緣皺縮，真葉正常；5級，子葉皺縮枯死，部分真葉發(fā)黃；7級，真葉發(fā)黃，部分葉片黃化或停止生長；9級，全株葉片黃化萎蔫或枯死。病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×該級代表值）/（總株數(shù)×最高級代表值）×100。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將平板對峙效果較好的木霉菌株（M2和MX）進行分離純化培養(yǎng)5 d后，轉(zhuǎn)接到PDA平板上，25℃分別培養(yǎng)3、6 d后觀察菌落形態(tài)、測量菌落直徑并記錄菌落形狀及顏色變化；用顯微鏡觀察分生孢子梗及分生孢子形態(tài)。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 采用TIANGEN公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取平板對峙效果較好的木霉基因組DNA，分別利用由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成的ITS通用引物對（ITS5和ITS4）[7]、rpb2引物對（fRPB2-5f和fRPB2-7cr）[8]和tef1-α引物對（EF1728F和TEF1LLErev）[9]進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)體系為25 μL：PremixTaq 12.5 μL，正反引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1 μL。PCR擴增條件：ITS引物為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。rpb2引物為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，59℃退火90 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。tef1-α引物為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，55℃退火90 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min?；厥誔CR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物由鉑尚生物科技（上海）有限公司完成堿基序列測定。將三段序列分別進行多重序列比對并剪切掉首尾未對齊的堿基片段后線性串聯(lián)拼接，從GeneBank中下載合適的木霉菌株序列進行相同處理，同源性比較分析后，利用MEGA 5.0和MrBayes軟件進行多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 木霉菌定殖能力的檢測

分別根據(jù)木霉菌的tef1-α及rpb2序列片段，通過IDT熒光定量PCR引物在線設(shè)計網(wǎng)站（http：//sg.idtdna.com/Scitools/Applications/RealTimePCR/Default.aspx）設(shè)計特異性引物，通過和NCBI中與目標(biāo)木霉菌株相似性高的木霉菌株相應(yīng)序列BLAST比對，并通過從土壤中分離收集的10株木霉菌片段擴增驗證，篩選目標(biāo)菌株的熒光定量PCR特異性引物對，得到的引物對為：綠木霉M2（TEF1-2-F：5′-AGTACGCTTGGGTTCTTGAC-3′；TEF1-2-R：5′-TCCTGGTTAGCACTGGTTTG-3′）；棘孢木霉MX（RPB2-X-F：5′-CTGGTGCGGTGGAATATCTC-3′，RPB2-X-R ：5′-TCGGATTTGTCTTGGTCTTGAG-3′）。用特異性引物擴增出目的菌株的特異性片段后，使用凝膠回收試劑盒對片段進行回收純化并測序檢測。純化后的片段用pGEM-T Easy Vector進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、驗證后用質(zhì)粒小提試劑盒進行質(zhì)粒提取，得到高純度重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒重新送交測序鑒定，鑒定完畢后，用紫外分光光度計測定其OD260值和OD280值，測其純度（1.8

拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度（ng/μL）×質(zhì)粒體積（μL）×6.02×1023（copies/mol）/{660（g/mol）×[載體長度（bp）+片段長度（bp）]}

將定量的質(zhì)粒按照拷貝數(shù)進行10 倍梯度稀釋，稀釋8個梯度作為qPCR標(biāo)準(zhǔn)品。

將苦瓜苗栽種到溫室中，栽苗時分別在根部加5 mL M2、MX木霉孢子懸浮液（濃度為1.0×109 cfu/mL）作為處理，每處理31株苗。分別在移栽0、7、14、21、28、35、42、49 d從各處理隨機取苗3株，將根際土、根、莖、葉樣本分裝后-80℃保存。分別用土壤樣本總DNA提取試劑盒及植物基因組DNA提取試劑盒提取各樣本DNA，將其稀釋至相同濃度后置于-20℃保存。

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系應(yīng)用TIANGEN公司的SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進行擴增。反應(yīng)體系為20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.6 μL，100 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O補足至20 μL。使用羅氏LC96熒光定量PCR儀進行擴增，擴增條件為：95℃ 15 min；95℃ 10 s，57℃ 20 s，72℃ 25 s，循環(huán)40次；熔解曲線分析條件為95℃ 10 s，60℃ 60 s，97℃ 1 s，每0.2℃收集熒光信號1 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防木霉的篩選及室內(nèi)拮抗苦瓜枯萎病菌的效果

將篩選得到的13株木霉菌株進行平板對峙培養(yǎng)和室內(nèi)拮抗試驗，得出兩株拮抗活性較好的木霉菌株M2、MX，對苦瓜枯萎病菌的平皿抑菌率分別為68.03%、76.29%。由表1可知，木霉菌株M2、MX的盆栽防效分別為54.63%、45.72%。

除尖孢鐮刀菌外，兩株木霉對多種病原菌均有較好的抑制作用，表現(xiàn)出廣譜的拮抗活性，在測試的病原菌中，兩株木霉對苦瓜枯萎病菌、玉米紋枯病菌抑制效果最好，對楊樹水泡潰瘍病菌、蘋果霉心病菌、核桃炭疽病菌和蘋果樹腐爛病菌的抑制效果次之，對甘薯根腐病菌、黃瓜褐斑病菌抑制效果較差。MX菌株對番茄灰霉病菌抑制效果顯著優(yōu)于M2菌株，但對小麥赤霉病菌的抑制效果低于M2菌株（表2）。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

木霉菌株M2在PDA培養(yǎng)基上生長較快，3 d可長滿整個平板，氣生菌絲濃密，大量的產(chǎn)孢簇形成綠色的同心輪紋；分生孢子梗呈半透明，向頂分枝不規(guī)則，每個分枝最頂端有3～6個緊密貼在一起的瓶梗，靠基部部分為緊貼在一起的分枝，分枝直角生出或向頂呈反射狀；瓶梗為壇形至安瓿形，基部縊縮，中部膨大，逐漸向頂變細(xì)，頂端著生分生孢子；分生孢子闊橢圓形，墨綠色。初步形態(tài)鑒定M2菌株為綠木霉。

MX菌株在PDA培養(yǎng)基上生長較快，4 d左右長滿整個平板，緊貼培養(yǎng)基表面產(chǎn)生短絨毛狀氣生菌絲；產(chǎn)孢簇離散分布于平板表面，初期白色，后期變綠；菌落有特殊芳香氣味；分生孢子梗頂端具兩個或多個瓶梗，瓶梗較直，安瓿形，中部稍微加粗，基部稍有縊縮，分生孢子球形至卵圓形，墨綠色。初步形態(tài)鑒定MX菌株為棘孢木霉。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

運用三對通用引物分別擴增出兩株木霉的ITS、tef1、rpb2基因序列，菌株M2的三段序列長度分別為577、581、954 bp，菌株MX的三段序列長度分別為512、587、1 094 bp。將兩株木霉的序列分別與下載的木霉菌株序列進行同源性比較，并構(gòu)建聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。

木霉菌株M2聚類到了Trichoderma virens進化枝上，MX菌株聚類到了Trichoderma asperellum進化枝上（圖1）。分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，M2菌株為綠木霉（Trichoderma virens），MX菌株為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

2.4 木霉定殖能力的檢測

2.4.1 qPCR引物特異性分析 M2菌株的特異性片段長度181 bp，MX菌株的特異性片段長度150 bp。通過10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的qPCR反應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取線性關(guān)系最好的4個梯度制備曲線。以模板起始濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以各濃度梯度的模板反應(yīng)循環(huán)閾值（Ct值）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。M2菌株的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.3427，相關(guān)系數(shù)為1.00，擴增效率為199%，回歸方程為Ct=-3.3427lg（copy number）+36.17；MX菌株的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.2087，相關(guān)系數(shù)1.00，擴增效率205%，回歸方程Ct=-3.2087lg（copy number）+36.24。由圖2分析可知，在60～98℃區(qū)間內(nèi)，兩曲線均僅有一個特異性峰，引物特異性良好。

2.4.2 M2、MX在苦瓜苗組織內(nèi)的定殖能力 木霉M2菌株在苦瓜根部有少量定殖，最高定殖量在7 d的樣本中檢測到，為2 365 copies/μL；在莖和葉組織中不能穩(wěn)定定殖，檢測到的定殖量均低于100 copies/μL。MX菌株在根、莖、葉組織中均不能穩(wěn)定定殖，檢測到的定殖量均低于100 copies/μL（圖3）。

2.4.3 M2、MX在土壤中的定殖能力 兩株木霉在土壤中均能夠穩(wěn)定定殖，在向土壤中施加木霉菌劑后1～2周，定殖量略有降低，隨后兩株木霉在土壤中穩(wěn)定定殖，檢測到的定殖量也隨時間逐漸增加，M2菌株49 d取樣檢測到的定殖量較0 d時提高1.08倍，MX菌株則提高1.49倍（圖4）。

3 討論與結(jié)論

木霉菌具有競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導(dǎo)抗性和協(xié)同拮抗作用等多重生防機制[11]，是一類防治范圍廣、效果顯著的生防菌。目前已報道木霉對作物的根腐病、冠腐病、莖腐病、赤霉病、枯萎病等尖孢鐮刀菌病害有很好的防效[12-15]，本研究篩選的綠木霉M2菌株和棘孢木霉MX菌株也表現(xiàn)出防病效果好、防病譜廣的特點，對苦瓜枯萎病的防效分別為54.63%和45.72%。良好的定殖能力是木霉發(fā)揮防病效果的前提[16-18]，張紅驥等[19]研究發(fā)現(xiàn)木霉菌在大豆根系的定殖能力與其防病效果有著緊密的聯(lián)系，趙興麗等[20]研究發(fā)現(xiàn)鉤狀木霉可以在辣椒根際定殖并發(fā)揮防病促生的作用。常規(guī)的稀釋涂布平板法不能很好地監(jiān)測木霉菌在植物組織及土壤中的定殖情況，實時熒光定量PCR技術(shù)通過檢測木霉菌目標(biāo)片段PCR擴增產(chǎn)物的熒光強度來檢測環(huán)境樣本中目標(biāo)木霉的種群量[12]，本研究應(yīng)用此技術(shù)對兩株木霉在49 d周期內(nèi)植物組織及土壤中的定殖能力進行了監(jiān)測，結(jié)果顯示，木霉菌株M2、MX在苦瓜植株的根、莖、葉部定殖能力均較差，在土壤中則能穩(wěn)定定殖，且在隨后的取樣周期內(nèi)檢測到的種群量逐漸增多，這與Montealegre等[21]研究的哈茨木霉防治土壤立枯絲核菌時的定殖趨勢一致，土壤中木霉的菌落數(shù)隨著時間延長而增加。賀字典等[22]應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測棘孢木霉在土壤中的定殖量時，42 d后定殖量才開始增長，本研究中木霉菌株M2、MX在14 d后定殖量即開始增長，這說明它們能更快速地在土壤中穩(wěn)定定殖，保護植物根系抵御病原菌的侵染。

綜上，綠木霉M2和棘孢木霉MX菌株對苦瓜枯萎病有較好的防病效果，且在土壤中有良好的定殖能力，能快速在土壤中穩(wěn)定定殖發(fā)揮生防作用，具有較大的應(yīng)用潛力。

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