利用SRAP檢驗(yàn)棉花種子純度

王桂峰　魏學(xué)文　王琰　宋煥

摘要： SRAP是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，分別利用SRAP技術(shù)和田間種植鑒定方法對(duì)對(duì)魯墾棉33號(hào)、仁和39號(hào)、魯棉研18號(hào)、中植棉2號(hào)、魯棉研36號(hào)共5個(gè)棉花品種進(jìn)行純度的鑒定，結(jié)果表明：SRAP鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果的一致性較好，利用SRAP標(biāo)記進(jìn)行種子純度鑒定，替代田間種植鑒定，操作簡(jiǎn)便，鑒定快速經(jīng)濟(jì)高效，同時(shí)可以克服田間種植鑒定周期長(zhǎng)、易受環(huán)境影響等缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：棉花種子；純度；檢驗(yàn)；SRAP

中圖分類號(hào)：S562.091 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-3143（2018）04-0002-05

DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2018.04.001

0 引言

種子純度，作為評(píng)價(jià)農(nóng)作物種子質(zhì)量的最重要指標(biāo)之一，只有達(dá)到相關(guān)規(guī)定的要求，才能真正發(fā)揮品種在產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆等方面的優(yōu)良特性。檢驗(yàn)農(nóng)作物品種種子純度的方法主要包括大田形態(tài)鑒定、生化標(biāo)記鑒定和分子標(biāo)記鑒定等三種方法。其中，大田形態(tài)標(biāo)記鑒定所需周期長(zhǎng)，存在誤差大，且對(duì)性狀差異小的品種鑒定難度高；生化標(biāo)記鑒定則受制于組織或器官特異性，存在較大的局限性。棉花種子純度鑒定技術(shù)是業(yè)界的一大難題[1-5]。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為品種鑒定提供了新的途徑。多種分子標(biāo)記方法已開(kāi)始用于品種純度和真?zhèn)蔚臋z驗(yàn)，也為棉花種子純度檢驗(yàn)提供了理論和可行方法。為此，項(xiàng)目組引進(jìn)了相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence Related Amplified Polymorphism，SRAP）技術(shù)，開(kāi)展棉花種子純度鑒定，為保證棉種質(zhì)量提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

SRAP是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)獨(dú)特的引物，對(duì)基因的開(kāi)放閱讀框（Open reading frames，ORFs）的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，該技術(shù)由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li等于2001年提出[6]。上游引物（Forward primer）長(zhǎng)17bp，包括5?端14bp的核心序列和3?端3bp選擇性堿基，其中核心序列前10bp為填充序列，無(wú)任何特異組成，后接“CCGG”序列特異結(jié)合G、C含量豐富的外顯子；下游引物（Reverse primer）長(zhǎng)18bp，包括5?端15bp的核心序列和3?端3個(gè)選擇堿基，其中核心序列前11bp為填充序列，接著是“AATT”序列，特異結(jié)合A、T含量豐富的啟動(dòng)子和內(nèi)含子。由于不同個(gè)體以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列變異很大，利用該引物對(duì)外顯子區(qū)域、內(nèi)含子區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增，從而產(chǎn)生多態(tài)性。

SRAP技術(shù)的引物具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、高效、產(chǎn)率高、易測(cè)序、便于克隆目標(biāo)片段等特點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、煙草、花生、蘿卜等多種作物的遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、重要性狀的標(biāo)記以及相關(guān)基因的定位克隆等方面[3，5，7-11]。

本研究從實(shí)用的目的出發(fā)，利用SRAP技術(shù)對(duì)棉花品種進(jìn)行鑒定和種子純度分析，同時(shí)參考田間鑒定結(jié)果，為棉花種子純度鑒定提供一個(gè)實(shí)用、快速、準(zhǔn)確、可行的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料與取樣方法

試驗(yàn)選用山東省棉花原原種場(chǎng)保存的不同種質(zhì)資源RM0001～RM0027及繁育較多的魯墾棉33號(hào)、仁和39號(hào)、魯棉研18號(hào)、中植棉2號(hào)及魯棉研36號(hào)等品種為實(shí)驗(yàn)材料。每個(gè)品種選取單株的幼葉，液氮速凍，-80℃保存，用于DNA提取。

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

利用CTAB法提取棉花DNA。本實(shí)驗(yàn)所有SRAP引物（表1）按照Li等提出的原則設(shè)計(jì)，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于PCR的Taq酶購(gòu)自TaKaRa公司。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制20μlPCR擴(kuò)增體系，PCR擴(kuò)增在LabCycler 48（SensoQuest GmbH， G?ttingen， Germany）PCR儀上進(jìn)行，程序?yàn)椋?4℃變性5 min；94℃變性60 s，35℃退火60 s，72℃延伸60 s，共5個(gè)循環(huán)；94℃變性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

電泳系統(tǒng)采用北京六一電泳儀，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%的非變性聚丙烯胺凝膠電泳檢測(cè)，180V恒壓電泳90 min。

1.4 銀染檢測(cè)

電泳結(jié)束后，用蒸餾水稍微沖洗凝膠，按以下方法銀染： 10%（V/V）乙醇和0.5%（V/V）冰乙酸固定15 min，；0.2% AgNO3溶液銀染20 min；蒸餾水漂洗5s左右，0.002%（wv）硫代硫酸鈉的水溶液漂洗2 min；用1% NaOH和0.5%甲醛溶液顯色至譜帶清晰；0.75%Na2CO3溶液終止顯色。之后自來(lái)水反復(fù)漂洗幾次，減少甲醛殘留。

1.5 SRAP引物的篩選

用棉花品種RM0001、RM002，對(duì)81對(duì)引物進(jìn)行篩選，從而篩選出可用于鑒定不同棉花品種種子純度的多態(tài)性引物。

1.6 遺傳多態(tài)性分析

用篩選出的引物對(duì)RM0001～RM0027以及魯墾棉33、仁和39、魯棉研18號(hào)、中植棉2及魯棉研36號(hào)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并記錄擴(kuò)增情況，按下列公式對(duì)各對(duì)引物的多態(tài)性信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：引物的多態(tài)性比率（%）=多態(tài)性條帶數(shù)/總條帶數(shù)×100%。

1.7 田間種植鑒定分析

分別于魯墾棉33號(hào)、仁和39號(hào)、魯棉研18號(hào)、中植棉2及魯棉研36號(hào)共5個(gè)品種的繁育田內(nèi)隨機(jī)選取100株，根據(jù)個(gè)品種的典型性狀，對(duì)品種植株和雜株進(jìn)行區(qū)分，從而進(jìn)行田間種植鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP引物的篩選

利用上文優(yōu)化的SRAP反應(yīng)體系，以棉花品種RM0001、RM002篩選81對(duì)SRAP引物組合。篩選結(jié)果表明，79對(duì)SRAP引物擴(kuò)增出條帶，并從79對(duì)引物中選擇23對(duì)條帶清晰、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的SRAP引物，對(duì)棉花材料進(jìn)行指紋圖譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 遺傳多態(tài)性分析

利用23對(duì)SRAP引物，以32份棉花材料的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同引物對(duì)在不同棉花品種中的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明， 152個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)被檢測(cè)到，多態(tài)性位點(diǎn)比例為73.08%，平均每對(duì)引物6.9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。其中， ME1-EM6和ME3-EM8引物檢測(cè)到的多態(tài)性位點(diǎn)最多，各為10個(gè)；ME5-EM4引物檢測(cè)到的多態(tài)性位點(diǎn)最少，為2個(gè)。

由于ME1-EM8與ME6-EM6引物對(duì)多態(tài)性較高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，能夠有效地區(qū)分5個(gè)棉花品種。因此，本實(shí)驗(yàn)采用這2對(duì)引物對(duì)棉花品種種子純度進(jìn)行鑒定分析。

2.3 5種棉花品種純度鑒定

利用ME1-EM8與ME6-EM6兩個(gè)引物組合對(duì)5種棉花品種進(jìn)行SRAP純度鑒定，結(jié)果表明，5個(gè)種棉花品種的純度分別為95.311%，97.873%，95.102%，94.799%和95.123%。SRAP純度鑒定結(jié)果與田間種植純度鑒定結(jié)果符合率分別為96.27%，98.86%，98.04%，98.75%和98.06%（表3）。

3 討論

3.1 關(guān)于SRAP擴(kuò)增譜帶的取舍

SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物在基因組中的拷貝數(shù)，以及引物及模板的同源性程度均與SRAP擴(kuò)增條帶的強(qiáng)弱有關(guān)。所以，SRAP引物作為DNA多態(tài)性標(biāo)記重要的取舍標(biāo)準(zhǔn)是重復(fù)性，同時(shí)也要兼顧PCR擴(kuò)增條帶的強(qiáng)弱程度。因?yàn)槿绻骋粯悠纺０錎NA質(zhì)量較差，則會(huì)造成該樣品的PCR擴(kuò)增條帶較弱；如果SRAP引物與模板DNA的匹配程度低，尤其當(dāng)退火溫度升高時(shí)，可能會(huì)多擴(kuò)增的穩(wěn)定性造成影響，從而造成某一個(gè)體的大部分帶與其它個(gè)體強(qiáng)度一致，但僅有一條或少數(shù)幾條條帶較弱的現(xiàn)象。所以，利用SRAP技術(shù)對(duì)一個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)鑒定分析時(shí)，為了提高鑒定的穩(wěn)定性，需要進(jìn)行全面的鑒定分析比較。即鑒定時(shí)應(yīng)進(jìn)行多次重復(fù)，選取多態(tài)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的引物對(duì)，用于鑒定分析，同時(shí)選取穩(wěn)定性高的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄。

3.2 利用SRAP標(biāo)記鑒定棉花品種種子純度的準(zhǔn)確性與真實(shí)性的影響因素

理論上，SRAP技術(shù)是在分子水平上對(duì)基因型進(jìn)行鑒定，其結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。本質(zhì)上，SRAP技術(shù)是PCR擴(kuò)增反應(yīng)，因此從采集樣品、編號(hào)、提取DNA等過(guò)程均應(yīng)做到準(zhǔn)確、一致而且無(wú)交叉污染，從而保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確真實(shí)。再者，PCR反應(yīng)條件與PCR結(jié)果假陽(yáng)性也是重要的影響因素，選擇高效的Taq酶和適宜的退火溫度，可以保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性。因此，應(yīng)選擇擴(kuò)增條帶簡(jiǎn)單、退火溫度影響不大或?qū)U(kuò)增條件不敏感的SRAP引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。其次，由于影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的因素較多，因此需要對(duì)不同鑒定材料以及不同品牌的PCR相關(guān)試劑進(jìn)行優(yōu)化，確保PCR反應(yīng)體系和程序適宜，從而提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確和真實(shí)。最后，利用SRAP技術(shù)進(jìn)行種子純度鑒定時(shí)，是對(duì)ORFs進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所以鑒定時(shí)使用的引物對(duì)越多，鑒定結(jié)果的可靠性越高，但成本也隨之提高。綜上，利用SRAP技術(shù)進(jìn)行種子純度鑒定時(shí)，選擇多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的SRAP引物對(duì)，以便達(dá)到鑒定種子純度的目的。

3.3 利用SRAP標(biāo)記鑒定棉花品種種子純度的可行性分析

通過(guò)對(duì)5種棉花純度的鑒定表明，SRAP鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果的一致性較好，因此，可以選擇SRAP標(biāo)記進(jìn)行種子鑒定，以替代田間種植鑒定，從而克服其鑒定周期長(zhǎng)、易受環(huán)境影響等缺點(diǎn)。同時(shí)，作物品種種子純度鑒定，不僅要求簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，還要考慮經(jīng)濟(jì)成本因素。在進(jìn)行種子純度鑒定時(shí)，SRAP技術(shù)是通過(guò)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)ORFs進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只需改變引物3′端的3bp的選擇性堿基即可得到大量的引物對(duì)，且上游引物與下游引物可自由搭配，因此用少量的引物即可獲得多種引物組合，具備操作簡(jiǎn)便，鑒定快速經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn)。

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