瀘型酒釀造過(guò)程中上層和下層酒醅的有機(jī)酸變化分析

徐 勇， 郎召偉， 沈咪娜， 王松濤， 張曉娟， 沈才洪， 陸震鳴

(1.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心, 四川 瀘州 646000; 2.江南大學(xué)a.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.生物工程學(xué)院;c.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無(wú)錫 214122)

引 言

白酒的風(fēng)味特點(diǎn)取決于含量?jī)H占2%左右的微量揮發(fā)性香氣成分，其含量、種類以及量比關(guān)系與白酒的香型和風(fēng)格有關(guān)，能夠?qū)θ说男嵊X(jué)、味覺(jué)引起豐富的感官刺激[1]。在濃香型白酒中，有機(jī)酸的含量在微量成分中僅次于揮發(fā)性酯類，是形成白酒口味的主要成分，也是生成酯類的重要前體[2-4]。這些有機(jī)酸可在酒醅蒸餾過(guò)程中進(jìn)入基酒，具有除苦、減澀、壓爆，斧正香氣和口味，柔和酒體，延長(zhǎng)和豐富白酒味感等作用，對(duì)提高白酒質(zhì)量、豐富白酒香氣具有重大意義[5-8]。

已有大量研究對(duì)白酒中的風(fēng)味物質(zhì)變化及檢測(cè)方法進(jìn)行過(guò)報(bào)道[1,9-13]，對(duì)白酒釀造酒醅中有機(jī)酸變化也有較多報(bào)道，如孫國(guó)炎等人[14]采用氣相色譜法對(duì)五糧液酒醅中有機(jī)酸組成規(guī)律進(jìn)行了研究探討，趙揚(yáng)揚(yáng)等人[15]對(duì)瀘州老窖發(fā)酵過(guò)程中不同窖帽高度酒醅中乙酸、丁酸、己酸的變化與微生物變化之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了探討，但對(duì)瀘型酒酒窖不同位置的酒醅中有機(jī)酸含量差異和發(fā)酵變化規(guī)律尚缺少深入研究?；诖耍疚牟捎酶咝б合嗌V法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)對(duì)瀘型酒上層和下層酒醅發(fā)酵過(guò)程中7種有機(jī)酸(丙酮酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、乙酸和檸檬酸)組成及其變化規(guī)律進(jìn)行了分析，為解析瀘型酒釀造機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

酒醅樣品：自酒醅入窖后發(fā)酵開(kāi)始，采用取樣器對(duì)上層和下層酒醅分別進(jìn)行取樣，每層各取3個(gè)樣品作為生物學(xué)重復(fù)，用冰袋迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃超低溫冰箱中儲(chǔ)存待用。每隔3天按照上述方法進(jìn)行取樣，持續(xù)至發(fā)酵結(jié)束(合計(jì)39天)，共13組樣品。

試劑：亞鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉和硫酸鋅，均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥試劑有限公司；丙酮酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、乙酸和檸檬酸，均為色譜純，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。

儀器與設(shè)備：高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)、Sep-Pak C18預(yù)處理柱(美國(guó)Waters公司)、Milli-Q Biocel超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)、高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)、KQ-50E型舒美超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、博訊 GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海圖新電子科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品含水量檢測(cè)

稱取2 g酒醅樣品至已烘至恒重的稱量瓶(40 mm×25 mm)內(nèi)，115 ℃干燥箱中烘約3 h至恒重，計(jì)算上層和下層酒醅中干醅的比例。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 HPLC分析樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL超純水，浸泡1 h，8000 rpm離心15 min后留上清液；吸取4 mL上清液加入106 g/L亞鐵氰化鉀和300 g/L硫酸鋅各1 mL去蛋白，渦旋混勻器vortex充分渦旋混勻，8000 rpm離心3 min；上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，Sep-Pak C18小柱除色素，然后用HPLC檢測(cè)有機(jī)酸含量[16]。

1.2.3 有機(jī)酸檢測(cè)的液相色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis dC185 μm，4.6 mm×150 mm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：20 mmol/L NaH2PO4，用磷酸調(diào)節(jié)其pH值為2.7。進(jìn)樣體積：10 μL。檢測(cè)器波長(zhǎng)：UV 210 nm[17-18]。

1.2.4 有機(jī)酸定量方法

按以下濃度配制有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液：11 mg/L丙酮酸、10.5 mg/L草酸、66 mg/L酒石酸、190.5mg/L琥珀酸、100.8 mg/L乳酸、70.8 mg/L乙酸和68.4 mg/L檸檬酸。將有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水按1∶0(標(biāo)準(zhǔn)溶液：超純水)、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7稀釋成5個(gè)不同濃度梯度，稀釋好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度從高到低順序進(jìn)行HPLC分析，繪制各有機(jī)酸的峰面積-濃度曲線，計(jì)算7種有機(jī)酸的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并以3倍信噪比計(jì)算出各有機(jī)酸的最低檢出限[19]?；貧w方程及相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 7種有機(jī)酸的線性回歸方程參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 上層酒醅發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的變化

上層酒醅連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中7種有機(jī)酸總含量的變化如圖1所示。

圖1 上層酒醅發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的總量變化

從圖1可知，在發(fā)酵的前6天，有機(jī)酸從26.89±0.41 mg/g干醅迅速增長(zhǎng)到41.01±0.61 mg/g干醅，之后呈現(xiàn)波動(dòng)、緩慢上升的趨勢(shì)，直到發(fā)酵結(jié)束時(shí)增長(zhǎng)到47.02±0.83 mg/g干醅。

乳酸、乙酸和檸檬酸的總量在上層酒醅發(fā)酵過(guò)程中占7種有機(jī)酸總含量的95%以上，這三種有機(jī)酸含量的變化情況如圖2所示。

圖2 上層酒醅中乳酸、乙酸、檸檬酸含量的變化

從圖2可知，瀘型酒上層酒醅中乳酸含量在發(fā)酵前6天從22.79±0.31 mg/g干醅快速增長(zhǎng)到35.97±0.42 mg/g干醅，之后緩慢上升，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到35.65±0.54 mg/g干醅。乳酸是白酒中非常重要的有機(jī)酸，可由酒醅中乳酸菌合成，可以增加白酒的厚重感，降低白酒的刺激感，是白酒中良好的呈味物質(zhì)。乳酸在發(fā)酵過(guò)程中還能與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)形成乳酸乙酯，能夠使酒體呈現(xiàn)優(yōu)雅的香氣。乙酸含量在發(fā)酵前期增長(zhǎng)緩慢，在第15～18天快速升高、達(dá)到7.03±0.37 mg/g干醅，然后急劇下降至2.25±0.22 mg/g干醅，隨后又緩慢增長(zhǎng)、至發(fā)酵結(jié)束達(dá)到3.78±0.23 mg/g干醅。檸檬酸含量在發(fā)酵前3天從初始的2.91±0.07 mg/g干醅逐漸下降至0.18±0.05 mg/g干醅，直到第18天一直維持在較低的水平，在18～21天內(nèi)急速上升至5.64 mg/g干醅、并維持至發(fā)酵結(jié)束。

上層酒醅中除了以上三種主體有機(jī)酸外，還有琥珀酸、酒石酸、草酸、丙酮酸，其相對(duì)含量較低，總含量在總有機(jī)酸中不到5%。其中，琥珀酸在發(fā)酵前期不斷增長(zhǎng)，第9天達(dá)到最高、為0.89±0.02 mg/g干醅，隨后逐漸下降，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)為0.65±0.04 mg/g干醅。丙酮酸在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中從0.05 mg/g干醅波動(dòng)上升至0.27±0.05 mg/g干醅。

2.2 下層酒醅發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的變化

下層酒醅發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化如圖3所示。

圖3 下層酒醅發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸總量變化

從圖3可知，下層酒醅發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量總體呈不斷增加的趨勢(shì)，前21天從開(kāi)始的26.97±0.44 mg/g干醅不斷增長(zhǎng)至60.02±0.36mg/g，隨后波動(dòng)上升，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)為72.18±0.11 mg/g干醅。與上層酒醅相比，下層酒醅有機(jī)酸含量增加了25.16 mg/g干醅。

與上層酒醅中相同的是，下層酒醅中乙酸、乳酸、檸檬酸是主體有機(jī)酸，三者含量占7種有機(jī)酸總含量的94%以上。下層酒醅中，乙酸、乳酸、檸檬酸在發(fā)酵過(guò)程中的變化規(guī)律如圖4所示。

圖4 下層酒醅中乳酸、乙酸、檸檬酸含量變化

從圖4可知，下層酒醅發(fā)酵過(guò)程中，乳酸含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，從開(kāi)始的22.79±0.31 mg/g干醅至發(fā)酵結(jié)束達(dá)到61.90±0.48 mg/g干醅。乙酸含量在前15天先增加后減少，然后快速上升，在第18天達(dá)到最大，第18～21天快速下降，之后波動(dòng)下降，直到發(fā)酵結(jié)束為1.69±0.07 mg/g干醅，乙酸這一變化規(guī)律與在上層酒醅中相似。檸檬酸含量在前3天不斷減少，之后維持在低水平，在18～21天快速上升，至發(fā)酵結(jié)束達(dá)到7.15±0.04 mg/g干醅，檸檬酸的變化規(guī)律也與在上層酒醅中相似。

下層酒醅中除了以上三種主要的有機(jī)酸以外，還有琥珀酸、酒石酸、草酸、丙酮酸，其相對(duì)含量較低，在總有機(jī)酸中不到5%。琥珀酸含量在前期不斷增長(zhǎng)，在第15天達(dá)到最高，為1.05±0.12 mg/g干醅，隨后不斷下降。

3 結(jié) 論

(1)瀘型酒發(fā)酵過(guò)程中，上、下層酒醅的有機(jī)酸總量整體上均呈上升趨勢(shì)，但在兩層中的變化規(guī)律略有不同，在上層酒醅中基本上是穩(wěn)定的增加，而在下層酒醅中，在發(fā)酵的前21天持續(xù)上升，隨后波動(dòng)上調(diào)，直至發(fā)酵結(jié)束。

(2)對(duì)酒醅發(fā)酵過(guò)程中7種有機(jī)酸的監(jiān)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸、乙酸、檸檬酸在上層、下層酒醅中均為主體有機(jī)酸，三者占這7種有機(jī)酸總含量的94%以上，且乳酸含量最高。在上層酒醅中，乳酸含量在第0～6天迅速上升，之后至發(fā)酵結(jié)束基本保持穩(wěn)定，而下層酒醅中乳酸的變化趨勢(shì)與總有機(jī)酸類似。乙酸和檸檬酸在上層和下層酒醅中變化趨勢(shì)相似，分別在第18天和第21天快速上升。

(3)酒醅發(fā)酵結(jié)束時(shí)，上層和下層酒醅中有機(jī)酸含量不同，下層的總有機(jī)酸和乳酸含量均比上層中高，其中有機(jī)酸總含量相差25.16 mg/g干醅。這可能是由于兩層酒醅的理化性質(zhì)有所不同，使得其微生物代謝活力和強(qiáng)度不同[20]，加上黃水從上層向下層滲透等各種因素，導(dǎo)致了有機(jī)酸含量在不同酒醅層之間的差異，但其具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。