氣管支氣管結(jié)核患者治療前后支氣管灌洗液中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平觀察

陳俊，袁保東，彭孝紅，姚芳，李佺，陳國(guó)璽，蘭星

(武漢市肺科醫(yī)院，武漢 430030)

近年來全世界結(jié)核疫情嚴(yán)重，結(jié)核感染率及發(fā)病率均升高。2015年全球新增結(jié)核患者約10 400萬，約1 800萬例患者死亡，我國(guó)為全球新發(fā)結(jié)核病例最多的6個(gè)國(guó)家之一。氣管支氣管結(jié)核(TBTB)是結(jié)核病中危害最大、傳染性最強(qiáng)、肺功能損害最重的一類結(jié)核病。TBTB治療困難、療程長(zhǎng)，部分患者甚至出現(xiàn)耐藥、結(jié)核復(fù)發(fā)、肺功能嚴(yán)重受損等。所以優(yōu)化TBTB治療方案并減少后遺癥是結(jié)核治療中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。氣道內(nèi)免疫治療可能成為新的突破點(diǎn)。有報(bào)道提出免疫因子TNF-α、IFN-γ、IL-6可作為結(jié)核感染后的有效生物標(biāo)志物[1～3]，在對(duì)結(jié)核分枝桿菌(簡(jiǎn)稱Mtb)的免疫應(yīng)答中扮演著重要角色。本文通過檢測(cè)TBTB患者支氣管灌洗液中細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6)水平，分析它們?cè)赥BTB發(fā)病及轉(zhuǎn)歸中的變化，探討這些細(xì)胞因子在TBTB病程中所起到的免疫調(diào)節(jié)作用及意義，為TBTB的氣道內(nèi)免疫治療提供理論依據(jù),進(jìn)一步優(yōu)化TBTB治療方案。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 TBTB組 選取我院2016年1～12月明確診斷的40例TBTB住院患者作為TBTB組。TBTB組男22例、女18例，年齡(36.75±12.45)歲，吸煙11例，有既往病史12例(糖尿病4例、慢性胃炎2例、乙肝病毒攜帶2例、胃大部切除1例、慢性咽炎1例、合并小兒麻痹癥后遺癥1例、有肺結(jié)核病史者1例)。TBTB診斷依據(jù)2012年氣管支氣管結(jié)核診斷和治療指南[4]。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有TBTB患者治療前痰結(jié)核菌涂片(STB)、痰結(jié)核菌培養(yǎng)(人型分枝桿菌，CTB)均陽性，CTB藥敏無耐藥，纖維支氣管鏡(簡(jiǎn)稱纖支鏡)檢查提示氣管、支氣管結(jié)核(病變累及主支氣管、葉、段支氣管，部分患者病變累及主氣管)，灌洗液普通細(xì)菌培養(yǎng)、霉菌涂片和培養(yǎng)均陰性，血清降鈣素(PCT)正常。TBTB組患者接受抗結(jié)核治療及異煙肼聯(lián)合地塞米松霧化吸入治療。所有患者定期隨訪，治療2月末患者痰STB均轉(zhuǎn)陰，纖支鏡檢查提示氣管、支氣管病變明顯好轉(zhuǎn)，肺部影像學(xué)較前吸收。治療前及治療1、2、6月，纖支鏡檢查時(shí)留取支氣管灌洗液。

1.1.2 菌陰組 選取同期住院診斷為菌陰肺結(jié)核患者40例(均為健康體檢時(shí)發(fā)現(xiàn))作為菌陰組。菌陰組男21例、女19例，年齡(34.13±11.42)歲，吸煙13例，有既往病史6例(糖尿病3例、慢性胃炎1例、乙肝病毒攜帶2例)。入選標(biāo)準(zhǔn)：3次STB及1次CTB均陰性，常規(guī)抗感染治療無效，臨床排除其他非結(jié)核性肺部疾患。胸部CT檢查符合典型結(jié)核影像學(xué)特征(經(jīng)兩位胸科影像學(xué)專家共同閱片證實(shí))。結(jié)核菌素試驗(yàn)(+++～++++)，T-spot陽性。纖支鏡檢查證實(shí)氣道無明顯異常(經(jīng)兩位纖支鏡專職醫(yī)生認(rèn)同)，選取病灶相應(yīng)肺段行支氣管灌洗留取標(biāo)本。受試者1個(gè)月內(nèi)無明顯呼吸道感染史,既往無心肺疾病和過敏性疾病史，纖支鏡灌洗液普通細(xì)菌培養(yǎng)、霉菌涂片和培養(yǎng)均陰性，PCT正常。菌陰組患者接受診斷性抗結(jié)核治療并隨訪觀察，抗結(jié)核治療2月，肺部影像學(xué)較前吸收好轉(zhuǎn)，診斷性治療有效。

1.1.3 對(duì)照組 選取同期住院行纖支鏡檢查的縱隔淋巴結(jié)結(jié)核患者8例、可疑縱隔腫瘤2例為對(duì)照組。對(duì)照組男6例、女4例，年齡(42.40±13.08)歲，吸煙5例，有既往病史4例(乙肝病毒攜帶2例、糖尿病1例、白細(xì)胞減少1例)。入選標(biāo)準(zhǔn)：胸部CT檢查肺部無實(shí)質(zhì)性病變(經(jīng)兩位胸科影像學(xué)專家共同閱片證實(shí))，纖支鏡檢查證實(shí)氣道無明顯異常(經(jīng)兩位纖支鏡專職醫(yī)生認(rèn)同)；受試者術(shù)前1個(gè)月內(nèi)無呼吸道感染史,既往無心肺疾病和過敏性疾病史；纖支鏡灌洗液普通細(xì)菌培養(yǎng)、霉菌涂片和培養(yǎng)均陰性，PCT正常；3次STB及1次CTB均陰性。纖支鏡檢查時(shí)選取同一肺段(右上支氣管)行支氣管灌洗留取標(biāo)本。

三組性別、年齡、吸煙比例、有既往史比例比較P均>0.05。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，患者知情同意。

1.2 支氣管灌洗液TNF-α、INF-γ、IL-6檢測(cè) 各組纖支鏡檢查時(shí)，每次灌洗10 mL(生理鹽水)，共3次，盡量回抽灌洗液留取標(biāo)本，低溫離心(2 000 r/min)，留取上清，置-80 ℃冰箱保存待測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6、INF-γ，試劑均購自上海滬鼎生物科技有限公司,按說明書操作。

2 結(jié)果

TBTB組治療前后及菌陰組、對(duì)照組支氣管灌洗液TNF-α、INF-γ、IL-6水平比較見表1。

3 討論

TBTB是發(fā)生在氣管、支氣管黏膜、黏膜下層平滑肌、軟骨及外膜的結(jié)核病[4]，屬于下呼吸道結(jié)核病，嚴(yán)重影響氣道結(jié)構(gòu)及功能。

表1 TBTB組治療前后及菌陰組、對(duì)照組支氣管灌洗液

注：與菌陰組及對(duì)照組相比，*P<0.05；與本組治療前相比，△P<0.05；與本組治療1月相比，○P<0.05；與本組治療2月相比，●P<0.05。

在TBTB發(fā)生發(fā)展過程中，有多種細(xì)胞因子參與了氣道內(nèi)的免疫應(yīng)答及其病理過程。有研究[2,3,5]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核患者的血清、胸腔積液以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的支氣管肺泡灌洗液中均可檢測(cè)出TNF-α、IFN-γ、IL-6，提出這些因子可作為結(jié)核感染后的有效生物標(biāo)志物。預(yù)防結(jié)核感染的AERAS-402氣溶膠疫苗接種引起恒河猴強(qiáng)大的細(xì)胞免疫應(yīng)答，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)特異性CD4及CD8效應(yīng)性T細(xì)胞，并產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α等[6]。但目前國(guó)內(nèi)外尚無TBTB患者支氣管灌洗液中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平研究的報(bào)道。

TNF-α是一類由激活的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等所分泌的細(xì)胞因子，有廣泛的生物學(xué)活性，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能并有利于清除胞內(nèi)Mtb，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生有效的肉芽腫應(yīng)答。Dorhoi等[7]發(fā)現(xiàn)，超高水平的TNF-α與結(jié)核病變加重相關(guān)，所以TNF-α起到保護(hù)性免疫和致炎的雙重作用，TNF-α表達(dá)的波動(dòng)可以明顯影響疾病的病程。TNF-α亦可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放IL-6，并調(diào)控早期IL-6的產(chǎn)生[8]，形成因子之間相互促進(jìn)、復(fù)雜的協(xié)同作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TBTB組治療前支氣管灌洗液中TNF-α較菌陰組、對(duì)照組明顯升高，TNF-α產(chǎn)生增多有利于激活多種免疫細(xì)胞及因子，促進(jìn)機(jī)體清除結(jié)核感染。Navarra等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在亞洲結(jié)核病流行地區(qū)，接受TNF-α拮抗劑治療的患者結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)增加。TBTB組患者治療2月時(shí)氣管、支氣管病變明顯好轉(zhuǎn)，肺部影像學(xué)較前吸收，TNF-α檢測(cè)值下降，與疾病恢復(fù)一致。Shameem等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在耐多藥肺結(jié)核(MDR-TB)患者中，血清TNF-α水平明顯高于其他結(jié)核病患者，建議將TNF-α作為MDR-TB患者對(duì)二線抗結(jié)核藥物治療有效的指標(biāo)。因本文未納入MDR-TB患者，若支氣管灌洗液中TNF-α持續(xù)升高，我們是否需要警惕MDR-TB可能，有待進(jìn)一步的研究。

IFN-γ主要由活化的Th1細(xì)胞產(chǎn)生，它可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化、清除胞內(nèi)Mtb,提高組織相容性復(fù)合物Ⅱ(MHC-Ⅱ)分子表達(dá)，促進(jìn)抗原識(shí)別[11]。IFN-γ水平的高低可區(qū)分活動(dòng)性和潛伏結(jié)核感染[12]。目前廣泛開展的t-spot檢測(cè)技術(shù)，可檢測(cè)血清IFN-γ水平用于診斷結(jié)核病。本研究發(fā)現(xiàn)TBTB組治療前支氣管灌洗液中IFN-γ水平較菌陰組、對(duì)照組明顯升高，提示IFN-γ升高與氣道內(nèi)結(jié)核感染相關(guān)。Adewole等[13]隨訪監(jiān)測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核患者在治療前3月血清IFN-γ水平，發(fā)現(xiàn)治療1月時(shí)較治療前水平升高，治療3月時(shí)血清IFN-γ明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)在治療1月時(shí)，TBTB組支氣管灌洗液中IFN-γ較治療前輕度升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能為有效的抗結(jié)核治療導(dǎo)致Mtb大量死亡，死亡菌體抗原刺激淋巴細(xì)胞導(dǎo)致肺組織T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生增加；其次為部分患者支氣管結(jié)核較重，病初干酪壞死物堵塞氣道，當(dāng)支氣管逐步通暢，灌洗液中IFN-γ檢測(cè)值較前升高。隨著病情好轉(zhuǎn)恢復(fù)，患者于治療2月IFN-γ水平明顯下降，治療6月時(shí)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

IL-6在炎癥及免疫反應(yīng)中起到多效應(yīng)性作用，并促進(jìn)結(jié)核感染后有效的宿主免疫反應(yīng)。其作用機(jī)制為促進(jìn)T、B細(xì)胞成熟，介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)。Lopes等[14]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6能刺激早期IFN-γ的產(chǎn)生,IL-6基因敲除小鼠IFN-γ產(chǎn)生低，提示IL-6在對(duì)Mtb的保護(hù)性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。IL-6水平升高可增強(qiáng)組織細(xì)胞對(duì)TNF-α的敏感性。而另一方面，IL-6又可下調(diào)巨噬細(xì)胞殺微生物活性，抑制INF-α的產(chǎn)生，由Mtb感染的巨噬細(xì)胞分泌的IL-6可抑制未感染的巨噬細(xì)胞對(duì)IFN-γ的反應(yīng)[15]。有研究表明，IL-6可能發(fā)揮多重效應(yīng)，并對(duì)宿主控制Mtb感染產(chǎn)生影響。本文發(fā)現(xiàn)TBTB組治療前支氣管灌洗液IL-6水平明顯高于菌陰組、對(duì)照組，但治療1月后較治療前明顯下降，早于TNF-α、IFN-γ，考慮可能與IL-6免疫調(diào)節(jié)的雙向性和復(fù)雜性相關(guān)，若IL-6水平持續(xù)升高，反而抑制受Mtb感染的巨噬細(xì)胞中IFN-γ誘導(dǎo)的自噬功能[16]，不利于炎癥恢復(fù)，可導(dǎo)致組織壞死加重及MDR-TB。TBTB組患者治療2月及治療6月支氣管灌洗液IL-6水平與菌陰組、對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fatima等[17]研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性肺結(jié)核和MDR-TB患者血清IL-6明顯高于接受抗結(jié)核治療的患者。本研究TBTB組患者抗結(jié)核治療后支氣管灌洗液IL-6水平也明顯下降。

本研究不足之處：因均為痰菌陽性的支氣管結(jié)核患者，支氣管肺泡灌洗治療有導(dǎo)致Mtb播散、病灶增多的風(fēng)險(xiǎn)，故纖支鏡治療留取標(biāo)本均采用支氣管灌洗，灌洗后盡量回抽留取標(biāo)本，以免灌洗液流入其他葉段支氣管導(dǎo)致細(xì)菌播散。其次需進(jìn)一步探討免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，更深層次了解免疫狀況及機(jī)制。