耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制及同源性分析

黃亞雨，涂海健，鄭磊

(1 南方醫(yī)科大學(xué)，廣州 510515；2南方醫(yī)科大學(xué)附屬莆田醫(yī)院;3 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院)

肺炎克雷伯菌常寄居于人體或動(dòng)物的皮膚、上呼吸道和腸道等部位，是院內(nèi)感染的重要致病菌之一。近年來(lái)，亞胺培南等碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物在臨床中使用廣泛，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)包括碳青霉烯類(lèi)藥物在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，肺炎克雷伯菌是檢出率最高的耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌[1]。2012年涂海健等[2]報(bào)道，耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌(CRKP)在該院檢出的多重耐藥肺炎克雷伯菌中所占比例高達(dá)11.81%(30/254)。在希臘和以色列兩個(gè)國(guó)家先后出現(xiàn)過(guò)CRKP暴發(fā)流行情況[3]。我國(guó)的產(chǎn)碳青霉烯類(lèi)酶的肺炎克雷伯菌是2007年由浙江大學(xué)Wei等[4]首先發(fā)現(xiàn)的。本研究對(duì)莆田學(xué)院附屬醫(yī)院收集的33株CRKP菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、改良Hodge試驗(yàn)、EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn)、碳青霉烯類(lèi)耐藥基因及細(xì)菌膜孔蛋白基因檢測(cè)、基因分子分型及同源性分析，旨在明確耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制，為臨床使用抗菌藥物及采取預(yù)防性措施提供依據(jù)。

1 材料

菌株：收集莆田學(xué)院附屬醫(yī)院2016年2月～2017年2月臨床分離的CRKP 33株，其中來(lái)自重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)17株、呼吸內(nèi)科病區(qū)7株、神經(jīng)外科3株、神經(jīng)內(nèi)科2株、心胸外科2株、泌尿外科及肝膽外科各1株。所有菌株經(jīng)法國(guó)生物梅里埃VITEK-Ⅱ compact自動(dòng)分析儀鑒定。大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603均購(gòu)于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

實(shí)驗(yàn)試劑：DNA Marker、PCR配套試劑及溴化乙錠購(gòu)自北京天根生化科技公司，瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Promega公司，擴(kuò)增引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；藥敏紙片購(gòu)自O(shè)xoid公司；M-H培養(yǎng)基和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自法國(guó)梅里埃微生物制品有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：VITEK-Ⅱ compact全自動(dòng)細(xì)菌分析儀(法國(guó)生物梅里埃生物工程有限公司)，凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)，F(xiàn)R-110紫外分析裝置(上海復(fù)日科技有限公司)，F(xiàn)R-250電泳儀(上海復(fù)日科技有限公司)，多用途水平電泳槽(北京百晶生物科技有限公司)，超凈工作臺(tái)(上海依普監(jiān)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)，微量加樣器(Eppendorf，德國(guó))。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn) 用GN-13藥敏卡對(duì)33株CRKP進(jìn)行藥敏測(cè)試，測(cè)試結(jié)果判定參照2015年版本CLSI判斷標(biāo)準(zhǔn)。33株CRKP對(duì)米諾環(huán)素的耐藥率為24%，對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為70%，對(duì)氨基糖類(lèi)抗菌藥物丁胺卡那霉素、慶大霉素及妥布霉素的耐藥率分別為82%、91%和91%，對(duì)舒普森及呋喃妥因的耐藥率均為91%，對(duì)氨芐西林、哌拉西林/他唑巴坦、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、氨芐西林鈉舒巴坦鈉、頭孢曲松、頭孢唑林、頭孢吡肟和頭孢他啶等8種抗菌藥物全部耐藥。

2.2 產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶菌株檢測(cè) 采用改良Hodge試驗(yàn)。按照美國(guó)CLSI 2015版(M100-S25)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范操作后判斷結(jié)果：待測(cè)菌株在美羅培南藥敏紙片抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)矢狀生長(zhǎng)為陽(yáng)性菌株，提示菌株產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶。本研究發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性菌株30株，陽(yáng)性率為90.9%。

2.3 產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶菌株檢測(cè) 采用EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[5]，采用亞胺培南紙片與EDTA紙片進(jìn)行EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn)。結(jié)果判斷：在滴加EDTA溶液的空白紙片方向處亞胺培南藥敏紙片抑菌圈擴(kuò)大者為陽(yáng)性菌株，提示該菌株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶。本研究發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性菌株1株，陽(yáng)性率為3.1%。

2.4 CRKP碳青霉烯類(lèi)耐藥基因及細(xì)菌膜孔蛋白基因檢測(cè) 8對(duì)碳青霉烯酶耐藥基因(KPC、SHV、VIM、IMP、GIM、GES、OXA-48基因)引物及2對(duì)膜孔蛋白基因(Ompk36膜孔蛋白基因及Ompk35膜孔蛋白基因)引物由上海生工合成并采用PCR法擴(kuò)增檢測(cè)。擴(kuò)增過(guò)程為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性20 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，以上步驟循環(huán)共35次，最后72 ℃延伸2 min。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后送上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)上進(jìn)行Blast比對(duì)分析。10對(duì)基因引物序列、退火溫度、片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶KPC基因32株(96.97%)、攜帶SHV基因30株(90.91%)、攜帶NDM-1型1株(3.03%)，未檢測(cè)到另6種基因；Ompk36膜孔蛋白基因缺失3株(9.09%)，Ompk35膜孔蛋白基因缺失1株(3.03%)。

2.5 CRKP基因分子分型及同源性分析 采用多位點(diǎn)序列分型(MLST)法及ERIC-PCR法對(duì)耐藥細(xì)菌進(jìn)行同源性分析及基因分子分型，此過(guò)程委托上海天昊生物科技有限公司完成。7對(duì)管家基因序列引物和ERIC引物見(jiàn)表2。33株CRKP被分為4個(gè)ERIC-PCR分型和3個(gè)序列型(ST)11型，其中ST11/A型29株、ST15/B型2株、ST11/C和ST2193/D各1株，見(jiàn)圖1。

表1 8對(duì)碳青霉烯酶耐藥基因引物及2對(duì)膜孔蛋白基因

表2 7對(duì)管家基因序列引物和ERIC引物序列、

3 討論

碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物是以亞胺培南、美羅培南和厄他培南為代表的一組具有特定分子結(jié)構(gòu)的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，殺菌活性優(yōu)于頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物，主要用于治療多重耐藥的肺炎克雷伯菌感染。但碳青霉烯類(lèi)與其他β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物一樣，隨著在臨床上的廣泛應(yīng)用,對(duì)其產(chǎn)生耐藥的肺炎克雷伯菌逐漸增多。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，33株CRKP，除了對(duì)米諾環(huán)素的耐藥率較低外,對(duì)另外15種包括亞胺培南在內(nèi)的抗菌藥物耐藥率均大于70%，說(shuō)明其耐藥性比較嚴(yán)重，只有米諾環(huán)素治療CRKP感染的效果較好。本研究結(jié)果顯示，33株耐藥菌株主要分布在7個(gè)臨床科室，多來(lái)自重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)或由重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)轉(zhuǎn)出至其他科室的患者，與此類(lèi)患者存在住院時(shí)間長(zhǎng)、病情危重、機(jī)體免疫力低下、高齡、長(zhǎng)期應(yīng)用抗菌藥物及呼吸機(jī)使用頻率高等感染高危因素有關(guān)。

圖1 33株CRKP菌株同源性分析結(jié)果

本研究采用改良Hodge試驗(yàn)和EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn)對(duì)33株CRKP進(jìn)行碳青霉烯酶表型篩查，結(jié)果顯示30株可能產(chǎn)碳青霉烯酶、1株可能產(chǎn)金屬酶，提示產(chǎn)碳青霉烯酶是CRKP對(duì)碳青霉烯酶類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要原因。為進(jìn)一步明確其耐藥機(jī)制，本研究對(duì)33株CRKP進(jìn)行了8對(duì)碳青霉烯酶耐藥基因的檢測(cè)。結(jié)果顯示，攜帶KPC基因32株，占96.97%，攜帶NDM-1基因1株，僅占3.03%；未檢測(cè)另外6種耐藥基因。提示產(chǎn)KPC酶是CRKP耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的主要機(jī)制，與文獻(xiàn)[6,7]報(bào)道一致。KPC酶屬于A類(lèi)碳青霉烯酶,絲氨酸結(jié)構(gòu)為其活性部位,按Bush分群屬于第2f亞組，是我國(guó)最常見(jiàn)的一種碳青霉烯酶,可導(dǎo)致菌株對(duì)氨曲南、碳青霉烯類(lèi)及青霉素類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。研究證實(shí)，攜帶KPC基因的肺炎克雷伯菌株對(duì)常用的抗菌藥物耐藥水平極高，并可在醫(yī)院內(nèi)傳播擴(kuò)散，臨床治療困難。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌感染者病死率顯著高于非產(chǎn)KPC酶菌感染者[8]。NDM-1酶屬于B類(lèi)碳青霉烯酶，是一類(lèi)能夠水解包括碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的金屬酶，因此攜帶NDM-1的耐藥細(xì)菌又被稱為“超級(jí)細(xì)菌”。產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的危害性不僅在于菌株本身嚴(yán)重的耐藥性，還在于該耐藥基因可通過(guò)與質(zhì)粒結(jié)合在不同種屬間快速傳播，極易引起耐藥菌株的暴發(fā)流行。另外，本研究發(fā)現(xiàn)了1株OmpK35膜孔蛋白基因及3株OmpK36膜孔蛋白基因缺失的菌株。膜孔蛋白基因缺失可導(dǎo)致細(xì)菌外膜孔蛋白表達(dá)缺失，從而降低對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的敏感性。有文獻(xiàn)報(bào)道,膜孔蛋白OmpK36表達(dá)缺失合并產(chǎn)SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌株常對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥[9]。分析本研究結(jié)果，產(chǎn)KPC酶是CRKP耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的主要機(jī)制，細(xì)菌產(chǎn)NDM-1酶及OmpK膜孔蛋白缺失亦為產(chǎn)生耐藥的原因。

MLST是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法，本研究采用該方法分析7個(gè)管家基因450 bp左右的核心片段的核酸序列，對(duì)CRKP的等位基因進(jìn)行了多樣性比較。不同的菌株對(duì)應(yīng)不同的ST。目前全球范圍內(nèi)肺炎克雷伯菌播散最廣的分子型是ST258，而中國(guó)報(bào)道的主要是ST11。本研究中30株CRKP的分子分型為ST11，為最常見(jiàn)的分子型，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致。30株ST11型CRKP中，29株為A型，說(shuō)明ST11型菌株同源性程度高，可在院內(nèi)克隆性傳播。

綜上所述，耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制與其攜帶KPC并產(chǎn)生KPC酶有關(guān)；CRKP大部分為ST11/A型，同源性程度高，可在院內(nèi)克隆性傳播。