姜黃素灌胃對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮損傷的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制

艾詩媛，張英

(西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州 646000)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)易累及冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈等，由AS所致的心、腦血管不良事件已經(jīng)成為當(dāng)前人類的首要死亡原因。大量研究表明，眾多致AS的危險(xiǎn)因素(如吸煙、高血壓、糖尿病、脂代謝紊亂以及血液流變學(xué)改變、缺氧、感染等)都能引起炎癥及氧化應(yīng)激并導(dǎo)致內(nèi)皮損傷與功能障礙，而炎癥、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷正是AS的幾個(gè)顯著特征[1]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)是常用于反映炎癥的指標(biāo)，丙二醛(MDA)及總抗氧化能力(T-AOC)是反映抗氧化能力及氧化應(yīng)激損傷程度的指標(biāo)。血管內(nèi)皮在維持血管穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著重要作用，血管內(nèi)皮不僅是一個(gè)屏障更是一個(gè)復(fù)雜的旁分泌器官，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、血管張力、血小板和白細(xì)胞與血管壁的相互作用等。內(nèi)皮損傷可使LDL-C大量沉積于內(nèi)膜下，LDL-C經(jīng)氧化修飾成ox-LDL后被單核-巨噬細(xì)胞吞噬形成泡沫細(xì)胞，從而開啟AS過程，還可導(dǎo)致血管舒、縮功能失常并促發(fā)血栓形成，從而引發(fā)心血管事件?？梢姡种蒲装Y與氧化應(yīng)激、保持血管內(nèi)皮完整與功能正常是防治AS的重要措施[2,3]。事實(shí)上，與AS斑塊一旦形成便難以消退不同，血管內(nèi)皮損傷與功能障礙是可以完全逆轉(zhuǎn)的。循環(huán)中NO含量、內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量是常用于反映血管內(nèi)皮功能及內(nèi)皮損傷的指標(biāo)。血紅素氧合酶-1(HO-1)是細(xì)胞內(nèi)一種可誘導(dǎo)的抗氧化酶，其過表達(dá)可有效拮抗炎癥和氧化應(yīng)激所致的組織與細(xì)胞損傷[4]。姜黃素是HO-1的天然誘導(dǎo)劑，能在基因水平誘導(dǎo)HO-1轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[5]，但姜黃素能否通過誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)AS患者血管內(nèi)皮損傷與功能障礙卻鮮見報(bào)道。2015年1月～2017年12月，本實(shí)驗(yàn)擬在大鼠AS模型上對(duì)此進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠32只，3月齡,體質(zhì)量(200±20)g，由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，在西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)。丙基硫氧嘧啶、膽酸鈉及膽固醇購自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，基礎(chǔ)飼料由西南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心提供。高脂飼料配制：0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、3%膽固醇、5%白糖、10%豬油(自制)、81.3%基礎(chǔ)飼料。主要試劑：維生素D3注射液及姜黃素購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，卵清白蛋白干粉、牛血清白蛋白干粉及HO-1蛋白活性的特異性抑制劑鋅原卟啉Ⅸ(ZnPPⅨ)購自Sigma公司，硫酸亞鐵購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，TNF-α、IL-6及NO檢測(cè)試劑盒購自Abcam公司，HO-1免疫組化檢測(cè)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，MDA、T-AOC檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物研究所。CD31抗體購自BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及AS模型制備 32只健康雄性SD大鼠給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、姜黃素組和姜黃素+ZnPPⅨ組。各組采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿頸前正中線切開皮膚，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并阻斷血流后，除對(duì)照組外的其余三組大鼠均用液氮冷凍該段血管15 s造成內(nèi)皮損傷，恢復(fù)血流后縫合傷口，給予高脂飼料喂養(yǎng)，并予腹腔注射維生素D3(首次60萬IU/kg，之后每周10萬IU/kg)，同時(shí)注射異種蛋白刺激免疫反應(yīng)(背部皮下注射牛血清白蛋白40 mg/kg，每周3次，共3周；腹腔注射卵清白蛋白2.5 mg/kg，每3天1次，共5次)，另在飲水中加入FeSO4(25 mg/100 mL)。對(duì)照組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈而不予液氮冷凍損傷，持續(xù)喂養(yǎng)普通飼料并按其余三組相同的時(shí)間及操作方式處理，但所用藥物均代之以生理鹽水。

1.2.2 藥物干預(yù) 從造模開始第14周，姜黃素組給予姜黃素100 mg/(kg·d)灌胃，姜黃素+ZnPPⅨ組給予姜黃素100 mg/(kg·d)灌胃及腹腔注射ZnPPⅨ 7.5 mg/kg隔日1次。模型組及對(duì)照組給予2 mL生理鹽水灌胃和1 mL生理鹽水腹腔注射。干預(yù)時(shí)間共2周。

1.2.3 標(biāo)本采集 干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血檢測(cè)各項(xiàng)生化指標(biāo)及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量。處死動(dòng)物取右側(cè)頸總動(dòng)脈用于HE染色和免疫組化檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá)。

1.2.4 頸總動(dòng)脈組織學(xué)觀察 所取血管組織按常規(guī)操作方法經(jīng)中性甲醛固定、石蠟包埋、切片、脫水、透明、HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。

1.2.5 血清TNF-α、IL-6、T-AOC、MDA、NO水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6，比色法檢測(cè)T-AOC及NO，TAB法檢測(cè)MDA，操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量測(cè)算 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。取外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，吸取適量細(xì)胞懸液于1.5 mL EP管中，離心收集細(xì)胞，加入100 μL PBS混勻后，加入CD31抗體，吹打混勻，避光孵育30 min后加入500 μL PBS緩沖液洗滌2次，1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞，再加入400 μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。用CD31陽性細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)的百分比代表循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 血管組織HO-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色。取各組大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，用石蠟包埋，制作切片，常規(guī)脫水透明，3% H2O2溶液室溫避光10 min滅活內(nèi)源性過氧化酶，抗原修復(fù)液加熱修復(fù)，冷卻后加5% BSA室溫靜置20 min，滴加HO-1一抗(1∶300)4 ℃過夜。滴加二抗，室溫靜置20 min，加SABC室溫20 min，DAB顯色8 min，蘇木精染液染色5 min，脫水透明后中性樹膠封片保存。光鏡下觀察，胞質(zhì)呈棕褐色者為HO-1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞。采用Image Proplus多媒體彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算每例切片3個(gè)不重疊的400倍視野中陽性染色的累積光密度值，以其代表HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組頸總動(dòng)脈病理組織學(xué)改變 光鏡下HE染色顯示，對(duì)照組血管內(nèi)皮光滑完整；中膜可見梭形平滑肌細(xì)胞，彈力纖維層結(jié)構(gòu)清晰完整，未見泡沫細(xì)胞。模型組動(dòng)脈壁明顯增厚，可見局部管壁向管腔突出，內(nèi)皮下有大量泡沫細(xì)胞聚集；中膜平滑肌細(xì)胞增生，排列紊亂。姜黃素組動(dòng)脈粥樣硬化病變明顯減輕，內(nèi)皮覆蓋完整。姜黃素+ZnPPⅨ組動(dòng)脈粥樣硬化病變與模型組相似甚至還有所加重。

2.2 各組血清TNF-α、IL-6、MDA、T-AOC水平比較 見表1。

表1 各組血清TNF-α、IL-6、T-AOC、MDA水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與姜黃素組比較，ΔP﹤0.05。

2.3 各組血清NO水平及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量比較 見表2。

表2 各組血清NO水平及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與姜黃素組比較，ΔP﹤0.05。

2.4 各組血管組織內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、模型組、姜黃素組、姜黃素+ZnPPⅨ組血管組織內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)分別為11 992.8±701.5、18 333.6±904.4、40 603.2±2 029.1、37 069.8±1 535.3，模型組、姜黃素組、姜黃素+ZnPPⅨ組與對(duì)照組相比，姜黃素組、姜黃素+ZnPPⅨ組與模型組相比，P均<0.05。

3 討論

大鼠常用于制備與人體病變相似的AS模型，但大鼠先天具有較強(qiáng)的抗AS能力，為此，我們對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的多種造模方法[6～8]進(jìn)行了綜合與改良：即在常規(guī)高脂飼養(yǎng)基礎(chǔ)上加用丙基硫氧嘧啶和維生素D3等藥物以減少脂質(zhì)消耗并促進(jìn)脂質(zhì)及鈣對(duì)血管壁的侵入和沉積，同時(shí)用液氮冷凍損傷血管內(nèi)皮，再結(jié)合皮下注射異種蛋白激發(fā)免疫性炎癥反應(yīng)并于飲水中加入FeSO4以增加氧化應(yīng)激等。結(jié)果顯示：模型組頸動(dòng)脈管壁增厚，結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)皮不完整，其下有大量泡沫細(xì)胞堆積，并有淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，表明AS模型制備成功。本實(shí)驗(yàn)中，模型組較對(duì)照組血清TNF-α、IL-6、MDA水平明顯升高而T-AOC明顯降低，且循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯增加以及血清NO水平明顯降低，表明模型組大鼠體內(nèi)存在明顯的炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)并伴血管內(nèi)皮細(xì)胞顯著損傷及功能障礙。這與臨床研究[9]顯示冠心病患者體內(nèi)也存在著炎癥與氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮損傷與功能障礙是相似的。鑒于內(nèi)皮損傷與AS及相關(guān)的心血管不良事件密切相關(guān)，探討有效逆轉(zhuǎn)AS模型大鼠血管內(nèi)皮損傷與功能障礙的方法對(duì)臨床防治冠心病具有借鑒意義。

姜黃素是從姜黃屬類植物根莖中提取的一種多酚化合物，其藥理機(jī)制復(fù)雜并具有多重細(xì)胞保護(hù)作用，包括抗炎、抗氧化、抗病毒、抑制AS等[10]。近年發(fā)現(xiàn)，姜黃素是HO-1的天然誘導(dǎo)劑，可通過活化核因子相關(guān)因子2/抗氧化劑反應(yīng)元件(Nrf2/ARE)這一特殊的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在基因轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)HO-1表達(dá)[5]。本研究中的姜黃素組、姜黃素+ZnPPⅨ組血管組織內(nèi)HO-1表達(dá)均有顯著增加則再次印證了這一點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素的許多藥理學(xué)作用可能主要是通過誘導(dǎo)HO-1表達(dá)介導(dǎo)的[5，11]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素組較模型組血清TNF-α、IL-6、MDA水平明顯降低而T-AOC明顯升高，對(duì)應(yīng)的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少同時(shí)血清NO水平明顯升高，表明姜黃素有效地發(fā)揮了抗炎、抗氧化及保護(hù)血管內(nèi)皮等作用。但姜黃素+ZnPPⅨ組以同樣的方法使用姜黃素，其炎癥與氧化應(yīng)激指標(biāo)卻遠(yuǎn)高于姜黃素組而與模型組相近，在減輕血管內(nèi)皮損傷的效果上也明顯不如姜黃素組，表明ZnPPⅨ能阻斷姜黃素的抗炎癥、抗氧化應(yīng)激與保護(hù)血管內(nèi)皮等作用，由于ZnPPⅨ是HO-1蛋白活性的特異性抑制劑，提示姜黃素的上述作用主要是通過誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

研究發(fā)現(xiàn)，HO-1是存在于細(xì)胞內(nèi)的一種可誘導(dǎo)型抗氧化酶，基礎(chǔ)表達(dá)水平較低，但各種致細(xì)胞損傷和應(yīng)激的理、化因素均可誘導(dǎo)其迅速表達(dá)。HO-1蛋白的主要生物學(xué)功能是催化細(xì)胞內(nèi)游離血紅素降解生成膽紅素與一氧化碳(CO)等產(chǎn)物。其中，膽紅素是一種細(xì)胞內(nèi)源性強(qiáng)抗氧化劑，能清除多種形式的自由基而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激性細(xì)胞損傷作用；CO則是與NO類似的又一細(xì)胞內(nèi)氣體信號(hào)分子，廣泛參與擴(kuò)血管、調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥、調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡等過程。HO-1/膽紅素/CO組成的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)在組織細(xì)胞應(yīng)對(duì)炎癥和氧化應(yīng)激損傷中不可或缺，合理上調(diào)HO-1表達(dá)是包括AS在內(nèi)的許多疾病的防治措施[4,12]。由此推測(cè)，膽紅素和CO是姜黃素誘導(dǎo)HO-1表達(dá)逆轉(zhuǎn)AS血管內(nèi)皮損傷的主要效應(yīng)分子。盡管各種損傷性理、化因素所致的氧化應(yīng)激都有可能引起HO-1適應(yīng)性表達(dá)，但許多病理狀態(tài)下的HO-1適應(yīng)性表達(dá)水平有限，尚不足以對(duì)抗致病因素所造成的損傷[13]。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，即模型組致AS的損傷因素雖然也在一定程度上誘導(dǎo)了HO-1表達(dá)，卻未能阻止血管內(nèi)皮損傷及功能障礙，而應(yīng)用姜黃素高效誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)則能顯著抑制AS大鼠業(yè)已升高的炎癥與氧化應(yīng)激水平，逆轉(zhuǎn)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，這一結(jié)果為姜黃素在AS性心血管疾病防治中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。