CRP基因沉默后心肌細胞系H9c2的miR-21及其靶基因表達、細胞活力觀察

程玲慧，余麗霞，葉鳳英，權磊，譚文

(1華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006；2華南理工大學醫(yī)學院；3廣東工業(yè)大學生物醫(yī)藥研究院)

缺血性心臟病是全世界致死率最高的疾病之一[1]。缺血缺氧會造成心肌細胞不可逆轉的損傷和壞死，并引起一系列劇烈的炎癥反應[2]。受損的心肌組織通過炎癥細胞清除傷口碎片，然而持續(xù)的炎癥反應會進一步加重心肌細胞的凋亡。C反應蛋白(CRP)是一類急性反應蛋白，在感染、炎癥或組織損傷的刺激下由肝臟快速合成[3]。在臨床實踐中，CRP一直被公認為重要的心血管疾病非特異性生物標志物。近來研究發(fā)現，以特異性的反義核苷酸降低大鼠血漿中CRP水平可以有效減少心肌梗死的面積[4]。相反地，對發(fā)生心肌梗死的小鼠皮下注射CRP可以增加心肌梗死面積，擴大心電圖ST段的上升幅度[5]。CRP不僅可用于臨床上對心血管疾病的早期診斷、篩查，還可作為功能性因子實質地參與心血管疾病病理變化，具有治療相關疾病的潛能。然而，目前尚無研究直接證明CRP對心肌細胞的表型或內在分子通路產生影響。2016年6月～2018年2月，本研究通過慢病毒介導體外沉默H9c2心肌細胞的CRP基因，利用實時定量PCR分析細胞中miR-21及其下游靶基因PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA的表達，探討沉默CRP基因對H9c2心肌細胞中miR-21及其下游靶基因的調控作用，研究體外沉默CRP基因對H9c2心肌細胞活力的影響，為臨床上治療心血管疾病提供分子基礎。

1 材料

實驗所用H9c2心肌細胞購自中國科學院上海細胞所。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰酶均購自Gibco公司，嘌呤霉素購自索萊寶科技有限公司。輔助包裝質粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G及轉染劑Polybrene由賽業(yè)生物科技有限公司提供。ArctutusTMPicopureTMRNA Isolation Kit、TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit、TaqMan?Universal Master Mix、superscript?Ⅲfirst-strand synthesis supermix for RT-qPCR和power upTMSYBR?green master mix試劑盒均購自賽默飛世爾生物公司。

2 方法與結果

2.1 沉默CRP基因載體構建與慢病毒包裝 沉默CRP基因的慢病毒載體及技術支持由賽業(yè)生物科技有限公司提供。慢病毒包裝采用四質粒包裝系統(tǒng)，按說明書將1種表達質粒與3種輔助包裝質粒共轉染293T細胞。轉染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基；轉染48 h后，收集病毒上清，按1 mL/支分裝所獲得濃縮的病毒顆粒，于-80 ℃長期保存。將濃縮的病毒顆粒按10倍倍比稀釋后分別感染293T細胞，感染24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況并計算病毒滴度。

2.2 H9c2心肌細胞的培養(yǎng) 以15% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9c2心肌細胞。當細胞貼壁70%～80%時，用0.08%胰酶消化約1 min，計數，以1∶2的比例傳代，大約3天傳代1次。取對數生長期的細胞，按3×105/孔的密度接種至6孔板內，每孔2 mL培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)過夜。次日，細胞匯合度為50%左右，每孔細胞數約為1×106，則可以進行下一步慢病毒轉染。

2.3 慢病毒轉染H9c2心肌細胞 取上述待實驗的H9c2心肌細胞，分為CRP沉默組和對照組。根據計算的病毒滴度，按感染復數20的病毒細胞比例加入慢病毒顆粒，其中CRP沉默組轉染對CRP特異性沉默的pLV-shRNA-CRP慢病毒，對照組轉染無敲減作用的pLV-shRNA-Scramble慢病毒。按5 μg/mL的最終濃度滴加轉染劑Polybrene，轉染后的細胞培養(yǎng)條件和常規(guī)培養(yǎng)條件相同。轉染6 h后，若出現細胞毒性則立即更換新鮮培養(yǎng)基，若無則繼續(xù)培養(yǎng)；轉染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。

2.4 慢病毒載體轉染H9c2心肌細胞的篩選與鑒定 轉染48 h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，熒光率達到60%左右，加入含有0.25 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基進行篩選。嘌呤霉素篩選H9c2心肌細胞兩代左右，觀察細胞的熒光情況。H9c2心肌細胞可見大量綠色熒光顆粒，與同一視野下明場相比，表達綠色熒光蛋白的H9c2心肌細胞有80%以上，說明慢病毒已成功轉染H9c2心肌細胞。此時用PBS溶液清洗兩遍，收集細胞并利用實時定量PCR鑒定CRP基因的沉默效率。

2.5 H9c2心肌細胞CRP基因的沉默效率 采用實時定量PCR法檢測。按ArctutusTMPicopureTMRNA Isolation Kit說明書從心肌細胞中提取RNA。根據superscript?Ⅲ first-strand synthesis supermix for RT-qPCR說明書合成cDNA，并利用power upTMSYBR?green master mix進行實時定量PCR。CRP上游引物5′-GCTTCTCTCAGGCTTTTGGTCA-3′，下游引物5′-GTCCCCACAATGTAGCCCTT-3′；GAPDH 上游引物5′-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3′，下游引物 5′-ACACCGACCTTCACCATCT-3′。PCR反應條件：95 ℃ 2 min，循環(huán)1次；50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次；溶解曲線95 ℃ 15 s，60℃ 60 s，95 ℃ 15 s，循環(huán)1次。采用2-ΔΔCt法計算CRP mRNA相對表達量。CRP沉默組和對照組H9c2心肌細胞中CRP mRNA相對表達量分別為0.320±0.069、1±0.090，兩組相比P<0.01。表明沉默CRP基因的H9c2心肌細胞株篩選成功。

2.6 H9c2心肌細胞miR-21表達 采用實時定量PCR法檢測。按ArctutusTMPicopureTMRNA Isolation Kit說明書從心肌細胞中提取RNA，使用TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit進行逆轉錄，TaqMan?Universal Master Mix進行實時定量。miR-21/U6引物均由賽默飛世爾生物公司提供(miR-21 Assay ID：000397，U6 Assay ID：001973)。PCR反應條件：50 ℃ 2 min，循環(huán)1次；95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計算miR-21的相對表達量。結果顯示，CRP沉默組和對照組miR-21相對表達量分別為0.740±0.099、0.280±0.010，兩組相比P<0.01。

2.7 H9c2心肌細胞PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表達 采用實時定量PCR法檢測。按ArctutusTMPicopureTMRNA Isolation Kit說明書從心肌細胞中提取RNA。根據superscript?Ⅲ first-strand synthesis supermix for RT-qPCR說明書合成cDNA，并利用power upTMSYBR?green master mix進行實時定量PCR。所用引物由上海捷瑞生物公司合成。PDCD4上游引物5′-GAGGCAAGGGTGTCTGG-3′，下游引物5′-CGTATCTCCGTGCTCAAAG-3′；PTEN上游引物5′-TGGGAAAGGACGGACTG-3′，下游引物5′-CGCCTCTGACTGGGAAT-3′；Spry1上游引物5′-CCCAGGCTCTGCACTAGGTA-3′，下游引物5′-AGTCAGCGGAAATCTGCCAT-3′；GAPDH上游引物5′-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3′，下游引物5′-ACACCGACCTTCACCATCT-3′。PCR反應條件：95 ℃ 2 min，循環(huán)1次；50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次；溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，循環(huán)1次。采用2-ΔΔCt法計算PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA相對表達量。CRP沉默組的PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表達均低于對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 兩組PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA

注：與對照組相比，*P<0.01。

2.8 H9c2心肌細胞活力檢測 采用MTT法檢測。按照每孔5×103的比例將H9c2心肌細胞接種于96孔板中。設置三個組別分別為空白組、對照組和CRP沉默組，每組設置4個復孔，并設置3次平行實驗。培養(yǎng)12 h后，空白組不轉染病毒加入等量的DMEM培養(yǎng)基，對照組轉染pLV-shRNA-Scramble慢病毒顆粒，CRP沉默組轉染pLV-shRNA-CRP慢病毒顆粒。轉染24 h后，取出96孔板，沿著各孔孔壁輕輕加入5 mg/mL的MTT原液10 μL，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。4 h后取出96孔板，輕輕翻轉96孔板，將其倒扣在干凈的濾紙上棄掉含MTT的培養(yǎng)基并防止紫色甲臜也被棄掉。往96孔板各孔中加入100 μL DMSO，在室溫、避光條件下，溶解搖勻紫色甲臜結晶20 min。用多功能酶標儀測定570 nm波長處的吸光度，整理數據并進行分析。CRP沉默組、對照組和空白組細胞活力分別為0.78±0.030、0.66±0.010、1.00±0.013；與空白組相比，CRP沉默組和對照組細胞活力均下降(P均<0.01)；與對照組相比，CRP沉默組細胞活力上升(P<0.05)。

3 討論

缺血性心臟病是一種常見的心血管疾病，嚴重威脅人類健康。在心臟血流供應長期受損情況下，缺血級聯反應將被激發(fā)，心肌細胞因缺血缺氧發(fā)生不可逆的壞死，導致大量心肌細胞損失，嚴重影響了心臟功能。此時心肌成纖維細胞增生，導致形成，發(fā)生心室重塑，心功能下降，最終可能導致心力衰竭[6]。

臨床上，對CRP與冠心病、心肌梗死、心律失常等之間的關系有比較深入的研究，已證實CRP是心血管疾病非特異性的預測因子與危險因子[7]。CRP作為心血管疾病重要的炎癥介質，可以誘導黏附分子在內皮細胞中表達，并在動脈粥樣硬化的炎癥反應中起關鍵作用[8]。此外，CRP損害內皮祖細胞的血管生成功能并減弱其存活和分化。Nagai等[9]證實，CRP通過炎癥反應增強了壓力超負荷引起的心臟重塑。在CRP轉基因小鼠模型中，CRP在高血管緊張素Ⅱ條件下促進心臟纖維化和炎癥反應[10]。事實上，CRP可增加大鼠新生心肌細胞缺氧誘導的凋亡和一氧化氮產生，CRP與受損心肌細胞中暴露的配體結合可導致補體系統(tǒng)介導的組織損傷的惡化[11]?？梢?，CRP不再單純地用于臨床上對疾病的早期診斷、篩查，而作為功能性因子參與心血管疾病病理變化，具有治療相關疾病的潛能。miR-21是目前研究較為成熟的miRNAs之一[12]。miR-21的功能重要性很大程度上取決于其調控的靶基因。PDCD4、PTEN和Spry1是當前miR-21參與介導的缺血性心血管病的重要靶基因。PDCD4抑制與細胞增殖有關的轉錄因子的合成，從而抑制細胞存活[13]。Cheng等[14]發(fā)現，經過氧化氫處理過的心肌細胞中，PDCD4和miR-21表達明顯上調。miR-21以PDCD4的mRNA作為靶標，保護心肌細胞免受缺血再復灌損傷并提高其存活率[15]，在心肌細胞生長、死亡和心臟成纖維細胞功能中發(fā)揮重要作用[16]。PTEN最初作為一種腫瘤抑制因子而被發(fā)現，其自身具有磷酸酯酶特性可誘導細胞凋亡[17]。Lee等[18]在研究CRP對H9c2心肌細胞中生存素表達影響時發(fā)現，CRP可以顯著增加促凋亡因子PTEN表達量。Spry1是受體酪氨酸激酶途徑的保守抑制劑，可負向調控多條RTK信號途徑，進而抑制細胞生長、遷移[19]。

本實驗首次將炎癥因子CRP和影響心血管疾病進程的重要因子miR-21聯系起來，發(fā)現CRP沉默組較對照組miR-21相對表達量高，PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表達均低，證實沉默CRP基因可以增加H9c2心肌細胞中miR-21的表達，抑制PDCD4、PTEN和Spry1表達，與沉默CRP基因對miR-21的促進作用相呼應。本實驗還發(fā)現，CRP沉默組和對照組較空白組細胞活力均下降，CRP沉默組較對照組細胞活力上升，表明沉默CRP基因可以顯著增加H9c2心肌細胞活力。PDCD4和PTEN都是促凋亡因子，PDCD4抑制與細胞增殖有關的轉錄因子的合成；而PTEN可以抑制PI3K-Akt信號通路，調節(jié)細胞的增殖、凋亡以及遷移等。Spry1主要在心肌成纖維細胞中表達，在H9c2心肌細胞中Spry1 mRNA的表達量非常低。因此，H9c2心肌細胞活力的增加很可能和沉默CRP基因后PDCD4、PTEN表達下降有關。

綜上可見，沉默CRP基因可促進H9c2心肌細胞存活，這可能與其可增加H9c2心肌細胞中miR-21表達，抑制PDCD4、PTEN和Spry1的基因表達有關。因此，CRP具有開發(fā)新型藥物治療缺血性心血管病的潛能。沉默CRP基因可能有助于減少缺血性心臟病病發(fā)生過程中的心肌細胞凋亡，從而改善心肌梗死等缺血性心臟病的預后狀況，降低心肌缺血后一系列并發(fā)癥的概率。但本實驗只基于正常的H9c2心肌細胞，要進一步明確沉默CRP基因可以促進動物體內miR-21表達并對缺血性心臟產生保護作用，還需要建立CRP敲除動物模型和缺血模型進行更全面、深入的探究。