金霉素高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化

解秀平

摘 要：金霉素是一種高效廣譜抗生素，對(duì)多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，適用于淺表皮膚感染。發(fā)酵效價(jià)測(cè)定：卡賽帕克C18MGⅡ液相色譜柱（4.6×250mm 5？滋m），0.01mol/L草酸溶液-乙腈-甲醇（10：3∶2），檢測(cè)波長為360nm，流速為1.0ml/min，柱溫為25℃。本實(shí)驗(yàn)對(duì)金霉素高產(chǎn)菌株選育并通過不同碳源、不同蛋白胨含量等以發(fā)酵效價(jià)為指標(biāo)對(duì)金霉素發(fā)酵工藝進(jìn)行研究。

關(guān)鍵詞：金霉素；工藝；研究

金霉素是一種高效廣譜抗生素，對(duì)多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)金葡菌、化膿性鏈球菌、肺炎球菌及淋球菌，以及沙眼衣原體等有較好抑制作用。金霉素適用于淺表皮膚感染。

工業(yè)微生物育種是建立在遺傳和變異的基礎(chǔ)上的，沒有變異，生物界將失去進(jìn)化的素材；沒有遺傳，變異也無法積累。通過金霉素高產(chǎn)菌株的選育我們可以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)金霉素高產(chǎn)菌株選育并通過不同碳源、不同蛋白胨含量等以發(fā)酵效價(jià)為指標(biāo)對(duì)金霉素發(fā)酵工藝進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 菌種

金色鏈霉菌（St reptomyces aureofaciens）。

1.2 材料與試劑

葡萄糖（山東西王糖業(yè)有限公司）、氯化鈉（西安泰華醫(yī)藥科技有限公司）、硫酸銨（西安泰華醫(yī)藥科技有限公司）、碳酸鈣（西安泰華醫(yī)藥科技有限公司）、磷酸氫二鉀（西安泰華醫(yī)藥科技有限公司）、磷酸氫二銨（西安泰華醫(yī)藥科技有限公司）、硫酸鎂（成都嘉葉生物科技有限公司）、瓊脂（上海瓊澤生物科技有限公司）、麩皮（河南隆霄生物科技有限公司）、蛋白胨（上海瓊澤生物科技有限公司）、酵母粉（上海瓊澤生物科技有限公司）、豆油（山東科興化工有限責(zé)任公司）、玉米淀粉（蘇州恒程化工科技有限公司）、小麥粉（河南隆霄生物科技有限公司）、花生粉（河南隆霄生物科技有限公司）、黃豆粉（河南隆霄生物科技有限公司）、淀粉酶（上海瓊澤生物科技有限公司）、淀粉（西安智誠生物科技有限公司）、糊精（西安智誠生物科技有限公司）、蔗糖（西安智誠生物科技有限公司）。草酸（上海慈太龍實(shí)業(yè)有限公司）、乙腈（上海慈太龍實(shí)業(yè)有限公司）、甲醇（上海慈太龍實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 儀器

KQ-300B型10L臺(tái)式超聲波清器（上海楚定分析儀器有限公司）、歐洲Radwag瑞德威電子天平（深圳市怡華新電子有限公司）、LAB-UPH-10T高端型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（臺(tái)上式）（四川蘭博環(huán)保設(shè)備有限公司）、Temp 300 雙通道熱電偶式溫計(jì)（賽默飛世爾科技水質(zhì)分析儀器）、GI-3000-12二元梯度高壓液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)（通用（深圳）儀器有限公司）、SG-8016A數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（上海碩光電子科技有限公司）、PHS-3C雷磁pH計(jì) （上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）、SP-723上海光譜分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）、HH-6030超級(jí)恒溫水槽（常州萬科儀器科技有限公司）、高速離心機(jī)（北京博勱行儀器有限公司）、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱（北京博勱行儀器有限公司）、卡賽帕克C18MGⅡ液相色譜柱（4.6×250mm5？滋m）。

1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.4.1 斜面培養(yǎng)基：磷酸氫二銨：硫酸鎂：瓊脂：麩皮：磷酸氫二鉀（0.015：0.005：2.0：3.2：0.02）32攝氏度培養(yǎng)4天。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)基：氯化鈉：硫酸銨：碳酸鈣：蛋白胨：酵母粉：硫酸鎂：豆油：玉米淀粉：花生粉：黃豆粉：淀粉酶（0.2：0.5：0.6：1.4：0.2：0.02：1.25：10：1.5：2.5：0.004），28攝氏度，轉(zhuǎn)速220r/min培養(yǎng)7天。

1.4.3 種子培養(yǎng)基：酵母粉：硫酸鎂：磷酸二氫鉀：玉米淀粉：黃豆粉；氯化鈉：硫酸銨：碳酸鈣：蛋白胨（0.6：0.025：0.03：4.0：2.0：0.2：0.3：0.5：0.5），濕熱滅菌二十分鐘，28攝氏度，轉(zhuǎn)速220r/min培養(yǎng)22天。

1.4.4 平板培養(yǎng)基

磷酸氫二銨：硫酸鎂：瓊脂：小麥粉：磷酸氫二鉀（0.015：0.005：2.0：2.0：0.02）濕熱滅菌二十分鐘，32攝氏度，培養(yǎng)4天。

1.5 分析方法

pH測(cè)定：酸度計(jì)測(cè)定。

發(fā)酵效價(jià)測(cè)定：高效液色譜法，卡賽帕克C18MGⅡ液相色譜柱（4.6×250mm5？滋m），0.01mol/L草酸溶液-乙腈-甲醇（10：3∶2），檢測(cè)波長為360nm，流速為1.0ml/min，柱溫為25℃。

1.6 誘變處理

將金色鏈霉菌新鮮斜面孢子制成單孢子懸浮液，采用紫外線誘變。經(jīng)紫外線誘變后的存活孢子涂于含0.9%氯化鋰的平板上，培養(yǎng)，孢子成熟后經(jīng)搖瓶發(fā)酵進(jìn)行初篩和復(fù)篩。

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)菌株選育

本實(shí)驗(yàn)金色鏈霉菌經(jīng)自然分離，得金霉素，效價(jià)高達(dá)23000μg/mL。

2.2 不同碳源對(duì)GDM生物合成的影響

本實(shí)驗(yàn)分別采用玉米淀粉、果糖、糊精、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇等作為唯一碳源進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明使用玉米淀粉時(shí)效價(jià)較高。

2.3 蛋白胨單因素對(duì)生物合成的影響

本實(shí)驗(yàn)分別采用不同含量的蛋白胨進(jìn)行試驗(yàn)，研究其對(duì)生物合成的影響。蛋白胨配比為0.9%時(shí)，三次實(shí)驗(yàn)的效價(jià)分別為22200μg/mL、22500μg/mL、21900μg/mL，平均為22200μg/mL。蛋白胨配比為1.1%時(shí)，三次實(shí)驗(yàn)的效價(jià)分別為23200μg/mL、23300μg/mL、22900μg/mL，平均為23133μg/mL。蛋白胨配比為1.3%時(shí)，三次實(shí)驗(yàn)的效價(jià)分別為21300μg/mL、21100μg/mL、21200μg/mL，平均為21200μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明蛋白胨含量為1.1%發(fā)酵效價(jià)最高。

2.4 酵母粉單因素對(duì)生物合成的影響

本實(shí)驗(yàn)分別采用不同含量的酵母粉進(jìn)行試驗(yàn)，研究其對(duì)生物合成的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明酵母粉含量為0.4%發(fā)酵效價(jià)最高。

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