武漢野田村病毒異源蛋白插入位點(diǎn)的篩選

司杰

摘要：為了評(píng)估武漢野田村病毒衣殼蛋白是否能形成一種新的異源多肽和蛋白的展示系統(tǒng)，本論文實(shí)驗(yàn)根據(jù)生物信息學(xué)手段，應(yīng)用穿線法（Threading）分析WhNV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)，選取氨基酸位置1/1L（131 aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa），L為在同一位點(diǎn)兩邊加Linker（甘氨酸短肽），插入報(bào)告蛋白EGFP的基因序列，以T-IE2質(zhì)粒為載體構(gòu)建可以瞬轉(zhuǎn)sf9的T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L的克隆。運(yùn)用熒光顯微鏡觀察及western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，篩選出能高效表達(dá)融合蛋白的位點(diǎn)克隆T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-5L。

關(guān)鍵詞：武漢野田村病毒；衣殼蛋白；EGFP蛋白；展示系統(tǒng)；位點(diǎn)篩選

1、前言

20世紀(jì)40年代以來(lái)，昆蟲(chóng)病毒作為生物殺蟲(chóng)劑的應(yīng)用前景，被漸漸發(fā)掘，特別是桿狀病毒已成為生物殺蟲(chóng)劑的主要來(lái)源。昆蟲(chóng)病毒的復(fù)制，裝配和宿主的相互影響終將會(huì)對(duì)生命科學(xué)研究產(chǎn)生重要影響，該領(lǐng)域已成為微生物研究領(lǐng)域中的熱門之一[1]。

菜青蟲(chóng)是菜粉蝶Artogeia（Pieris） rapae （Linnaeus） 又名菜白蝶、白粉蝶的幼蟲(chóng)，菜粉蝶屬粉蝶科中的鱗翅目。菜青蟲(chóng)主以幼蟲(chóng)啃食作物葉片的方式危害甘藍(lán)、蘿卜、花椰菜等十字花科蔬菜，導(dǎo)致收成量減少。武漢野田村病毒是在我國(guó)境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)能以昆蟲(chóng)為感染宿主的野田村病毒，也是第一次從菜青蟲(chóng)體內(nèi)分離得到的野田村病毒科成員。目前，對(duì)于菜青蟲(chóng)病毒的研究可以對(duì)蟲(chóng)害的防治提供理論依據(jù)[2]。

武漢野田村病毒是單鏈正義RNA病毒，其基因組全長(zhǎng)約為4.6 kb，包括RNA1（3.1 kb）和RNA2（1.5 kb）。RNA1編碼RNA依賴的RNA聚合酶 protein A，protein A不但復(fù)制基因組RNA，同時(shí)在病毒增殖過(guò)程中復(fù)制亞基因RNA3；RNA2編碼衣殼蛋白前體Pro α，在裝配過(guò)程中180個(gè)拷貝的Pro α組裝成T=3的正二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)自我切割后成為成熟的具有感染性的病毒粒子。野田村病毒衣殼蛋白中有一個(gè)β桶狀結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)在已經(jīng)研究的野田村病毒科的成員中都呈保守趨勢(shì)。桶狀結(jié)構(gòu)的反向平行鏈通過(guò)幾個(gè)形狀大小都不同的裸露在病毒粒子表面的莖環(huán)相連。表面的莖環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)象差別很大，由此推測(cè)野田村病毒的衣殼在表面莖環(huán)的構(gòu)象改變的情況下仍能折疊和組裝正確形成病毒粒子，因而，較大的異源多肽或完整的蛋白可以插入到這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，卻對(duì)衣殼蛋白影響不大。這些特性使得野田村病毒的衣殼蛋白可以作為一種新的異源多肽和蛋白的展示系統(tǒng)[4]。野田村病毒科中的Flock House virus（FHV）[5]衣殼蛋白結(jié)構(gòu)的研究顯示該蛋白表面有5個(gè)莖環(huán)，在這些莖環(huán)中插入異源多肽時(shí)不會(huì)引起較大的結(jié)構(gòu)變化。目前，已經(jīng)成功融合到VLPs的異源多肽包括人類免疫缺陷性病毒（HIV）的包膜蛋白gp41、乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg，人炭疽熱毒性受體2（ANTXR2[6]。同作為野田村病毒科成員的武漢野田村病毒衣殼蛋白的相關(guān)研究卻處于空白階段。

2、武漢野田村病毒衣殼蛋白插入異源蛋白位點(diǎn)的預(yù)測(cè)及克隆的構(gòu)建

2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1.1實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1.1生物信息學(xué)軟件（robetta在線模建服務(wù)器，Swiss-PdbViewer VERSION 4.0.1

2.1.1.2質(zhì)粒、菌種

pIZT/V5-his載體，pMD18-T-simple （TaKaRa公司），T-IE2載體質(zhì)粒，載體由pIZT/V5-his改造，即PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子OpIE2啟動(dòng)子序列后，連接pMD18-T-simple載體構(gòu)成，全長(zhǎng)3567bp，Amp抗性，pWh2（G，0）質(zhì)粒即RNA2的cDNA克隆，載體為pMD18-T（TaKaRa公司），大腸桿菌TOP10

2.1.2方法

2.1.2.1WhNV衣殼蛋白的三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

運(yùn)用穿線法測(cè)定武漢野田村病毒衣殼蛋白的三維結(jié)構(gòu)；

a）在數(shù)據(jù)庫(kù)中取一條已知模板與武漢野田村病毒衣殼蛋白序列作序列比對(duì)。

b）將模板蛋白質(zhì)序列匹配上的殘基的空間坐標(biāo)賦給武漢野田村病毒衣殼蛋白上的相應(yīng)殘基。

c）將這個(gè)操作應(yīng)用于所有的取用模板中，取能量值最低的模板產(chǎn)生的武漢野田村病毒衣殼蛋白序列的空間坐標(biāo)，即為武漢野田村病毒衣殼蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

2.1.2.2引物設(shè)計(jì)及插入EGFP的完整序列的克隆

用Primer5.0根據(jù)衣殼蛋白的ORF及EGFP設(shè)計(jì)引物。包括兩端分別包含EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)引物；EGFP插入預(yù)測(cè)位點(diǎn)1/1L（131 aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa），L為在同一位點(diǎn)兩邊加Linker（甘氨酸短肽），示意圖如下（2.1）

圖2.1.：131aa-132aa，14aa-149aa，180aa-181aa，191aa-192aa，209aa-210aa間插入EGFP ；131 aa -132 aa，209 aa -210 aa間插入加linker的EGFP

以衣殼蛋白序列和EGFP序列為模板，使用以上引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 將回收產(chǎn)物與T-IE2載體分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切5小時(shí)。回收酶切產(chǎn)物以T4連接酶16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂amp抗性平板，挑取平板上的單菌落，接種于4ml氨芐抗性培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，搖床培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，電泳測(cè)序鑒定。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1武漢野田村病毒衣殼蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用數(shù)據(jù)庫(kù)提供的模板，運(yùn)用穿線法模建衣殼蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖，運(yùn)用Swiss-PdbViewer展示單體如圖2.2。單體是由α螺旋，β折疊片及連接不同折疊間的莖環(huán)組成。β折疊片編織成致密的β桶，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，不能選擇成為插入位點(diǎn)，而松散在表面的莖環(huán)插入異源多肽時(shí)不會(huì)引起較大的結(jié)構(gòu)變化[7]。

2.2.2插入EGFP的完整序列的克隆鑒定

武漢野田村病毒衣殼蛋白ORF長(zhǎng)1293bp，EGFP的ORF長(zhǎng)717bp，添加linker18氨基酸長(zhǎng)54bp，即完整序列1，3，4， 5為2010bp，1L，5L為2064bp。T-IE2載體長(zhǎng)3567bp。節(jié)選圖2.3-2.5中泳道3中出現(xiàn)，3條帶是雙酶切不完全造成，最上面一條為單酶切產(chǎn)物，中間一條為切下的線型T-IE2空載，最下面一條為完整序列。陸續(xù)送樣測(cè)序，最終所有選定的預(yù)測(cè)位點(diǎn)1/1L（131aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa）的克隆T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L構(gòu)建正確。

3、武漢野田村病毒衣殼蛋白插入異源蛋白可行性位點(diǎn)的初步篩選

3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法

3.1.1實(shí)驗(yàn)材料

3.1.1.1化學(xué)試劑

抗生素氨芐和鏈霉素（invitrogen），標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（杭州四季青公司）顯色底物NBT/BCIP（碧云天公司），六孔細(xì)胞板，F(xiàn)uGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑盒（Roche），熒光倒置顯微鏡Nikon Eclipse TE 2000-U Fluorescencemicroscope（Nikon， Tokyo， Japan），Bio-Rad公司蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，抗EGFP標(biāo)簽鼠單克隆抗體（康為世紀(jì)），羊抗鼠AP標(biāo)記的抗體（北京康為公司），衣殼蛋白兔源抗體（免疫新西蘭白兔制得）

3.1.1.2質(zhì)粒，細(xì)胞

草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供；第二章所構(gòu)建好的質(zhì)粒標(biāo)簽為1，1L，2，3，4，5，5L。

3.1.2方法

細(xì)胞培養(yǎng)基的配制；質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及熒光顯微鏡觀察；Western blot方法檢測(cè)衣殼蛋白插入EGFP的重組蛋白（具體做法參照文獻(xiàn)8進(jìn)行.）

3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光觀察

將第二章中構(gòu)建成功的T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L及對(duì)照組T-IE2-EGFP質(zhì)粒提純轉(zhuǎn)染進(jìn)狀態(tài)穩(wěn)定，長(zhǎng)勢(shì)良好的sf9細(xì)胞，48小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察（如圖3.1）

3.2.2融合EGFP的衣殼蛋白的western-blot檢測(cè)

M，蛋白marker（130kDa，fermentas）；1，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空細(xì)胞；2，轉(zhuǎn)染T-IE2-1；3，轉(zhuǎn)染T-IE2-1L；4，轉(zhuǎn)染T-IE2-2；5，轉(zhuǎn)染T-IE2-3；6，轉(zhuǎn)染T-IE2-4；7，轉(zhuǎn)染T-IE2-5；8，轉(zhuǎn)染T-IE2-5L

將3.2.1中的觀察過(guò)的轉(zhuǎn)染T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L的細(xì)胞收集，制樣，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗1：2000抗EGFP標(biāo)簽鼠單克隆抗體，二抗1：1000羊抗鼠AP標(biāo)記的抗體，顯色如圖3.2。

3.3討論

熒光圖片中，實(shí)驗(yàn)組的熒光亮度即使是最亮的1和1L仍然沒(méi)有陽(yáng)性對(duì)照組的亮度強(qiáng)，說(shuō)明融合蛋白的包裝折疊是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，只有折疊正確的EGFP才會(huì)有熒光產(chǎn)生，兩種蛋白相互作用相互影響各自的構(gòu)象，顯然包裝效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型EGFP。由圖中看出Loop1和Loop2都產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，Loop3和Loop4幾乎沒(méi)有熒光，說(shuō)明這兩個(gè)位點(diǎn)不適合引入異源蛋白，插入的序列很可能被衣殼蛋白包裝進(jìn)內(nèi)部。Loop5產(chǎn)生了微弱熒光，在添加linker后的5L位點(diǎn)，熒光亮度大大增強(qiáng) ，同種情況也體現(xiàn)在1L上。說(shuō)明linker可以有效的增強(qiáng)插入外源蛋白或者多肽的空間柔韌性，能夠促使重組衣殼蛋白的正確包裝。

由于衣殼蛋白的ORF約2kb，EGFP的ORF約717bp，由此測(cè)算融合蛋白的大小約75KD。Western-blot結(jié)果同熒光觀察的結(jié)果較一致1/1L，2，5/5L，都能觀測(cè)到約75KD的條帶，其中1和1L的融合蛋白表達(dá)量幾乎一致，2次之，5L幾乎與2一致，Loop5量較少，Loop3和Loop4觀測(cè)不到熒光但western同樣出現(xiàn)了條帶，分析可能是表達(dá)了融合蛋白，卻是折疊包裝后構(gòu)象不正確，不能使EGFP發(fā)光，但western檢測(cè)的是變性的蛋白，所以同樣可以看到正確大小的蛋白。本實(shí)驗(yàn)中篩選出的表達(dá)效率較高的1/1L（131aa-132aa）已經(jīng)可以為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)電鏡觀察病毒類似粒子構(gòu)筑了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)：

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