普瑞巴林對(duì)CCI模型大鼠脊髓GFAP和SP表達(dá)的影響*

張嘉航 韓立偉 曲靜波 周華成 賈雅蕊 劉金鋒△

（1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院疼痛科，黑龍江麻醉與危重病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150086；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院疼痛科，哈爾濱 150086；3菏澤市立醫(yī)院麻醉科，菏澤 274000）

2011年，國(guó)際疼痛學(xué)會(huì) (International Association for the Study of Pain, IASP) 將神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP) 定義更新為由軀體感覺系統(tǒng)的損害或疾病導(dǎo)致的疼痛[1]，這種疾病在普通人群中的發(fā)病率約為3.3%～8.2%[2]，在有些國(guó)家神經(jīng)病理性疼痛患病率已經(jīng)高達(dá)6.9%～10%[3]。長(zhǎng)期慢性疼痛不但影響病人的睡眠和生活，還會(huì)增加抑郁、焦慮等情感障礙的發(fā)病率。目前神經(jīng)病理性疼痛的臨床治療仍以藥物為主，但由于該疾病發(fā)生機(jī)制復(fù)雜、治療藥物及方法缺乏特異性，使得探索神經(jīng)病理性疼痛的有效治療措施成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界亟待攻克的難題之一[4]。

普瑞巴林(pregabalin, PGB)作為一種新型抗癲癇藥物，更多研究關(guān)注的是其對(duì)慢性疼痛的治療效果。目前已被多個(gè)國(guó)際指南推薦為治療神經(jīng)病理性疼痛的一線藥物[5]，臨床廣泛應(yīng)用于糖尿病性外周神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛等疾病的治療。自2004年普瑞巴林在美國(guó)上市以來，關(guān)于它治療神經(jīng)病理性疼痛的研究越來越多，但時(shí)至今日普瑞巴林治療神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制仍尚未完全明確。不斷完善普瑞巴林的作用機(jī)制，不僅對(duì)治療神經(jīng)病理性疼痛臨床用藥方案提供理論基礎(chǔ)，而且對(duì)于尋找普瑞巴林作用靶點(diǎn)、藥物適應(yīng)癥擴(kuò)充以及藥物間相互作用具有重要意義。

近年來，大量研究結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞激活是慢性神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生與維持的重要機(jī)制之一，膠質(zhì)細(xì)胞的激活機(jī)制和功能研究成為神經(jīng)病理性疼痛研究的一大熱點(diǎn)[6]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP) 的表達(dá)是星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)志，反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能和狀態(tài)[7]。P物質(zhì) (substance P, SP) 不但可以傳遞傷害性信息，而且可以調(diào)控脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞功能。有研究顯示一定濃度的SP能夠誘發(fā)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[8]。因此，研究普瑞巴林是否通過SP對(duì)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化產(chǎn)生影響，有助于進(jìn)一步明確神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生與維持的機(jī)制，為神經(jīng)病理性疼痛的臨床治療提供新的思路。

本實(shí)驗(yàn)擬通過建立大鼠經(jīng)典坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷 (chronic constriction injury, CCI) 模型，觀察普瑞巴林對(duì)模型大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和SP表達(dá)的影響，同時(shí)結(jié)合模型大鼠機(jī)械刺激縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期值隨時(shí)間的變化趨勢(shì)及鎮(zhèn)痛效果，進(jìn)一步探討普瑞巴林對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的治療效果及其作用機(jī)制，旨在為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象

雄性清潔級(jí)SD大鼠 (200～220 g) 由中國(guó)北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SCXK（京）2016 - 0011。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)于溫度光照適宜的動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)3日，12小時(shí)黑/白光照，自由進(jìn)食飲水。

2.主要儀器及試劑

普瑞巴林（LYRICA,美國(guó)輝瑞制藥公司）；肝素（浙江萬邦醫(yī)藥公司）；多聚甲醛固定液（Paraformaldehyde，Sigma，德國(guó)）；GFAP多克隆抗體（湖北武漢博士德公司）；SP多克隆抗體（湖北武漢博士德公司）；二抗（中杉金橋生物技術(shù)公司）；七氟烷（上海恒瑞醫(yī)藥）；手術(shù)器械：外科手術(shù)刀、眼科剪、彎鑷、血管鉗、縫合針等（均為六六手術(shù)器械有限公司，蘇州）；光學(xué)顯微鏡（NIKON80i，日本）；Von Frey 纖維絲測(cè)痛儀（Stoelting，美國(guó)）；熱板測(cè)痛儀（model YLS-6B，益延科技發(fā)展有限公司，山東）；小動(dòng)物麻醉機(jī)（HARVARD公司，美國(guó)）。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

經(jīng)痛閾測(cè)定后排除痛閾異常的大鼠，最終入選30只健康SD大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表方法分為3組(n= 10)：假手術(shù)組 （S組），大鼠僅暴露右側(cè)后肢坐骨神經(jīng)，不做結(jié)扎環(huán)，逐層縫合切口；CCI組 （C組），僅建立大鼠CCI模型；普瑞巴林組 （P組），于術(shù)后第7 d至第14 d取材止，60 mg/kg普瑞巴林每日一次對(duì)CCI模型大鼠灌胃 （溶于4 ml生理鹽水中）。S組和C組大鼠灌注同等容積生理鹽水。

4.神經(jīng)病理性疼痛模型的制備

參照Bennett[9]的方法建立大鼠CCI模型：大鼠七氟烷吸入麻醉后左側(cè)臥位固定在操作臺(tái)上，右側(cè)后肢皮膚去毛備皮消毒，于坐骨結(jié)節(jié)處切開皮膚，鈍性分離各層肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用4-0的羊腸線打4個(gè)松緊合適的結(jié)，間距約為1 mm，結(jié)扎強(qiáng)度以顯微鏡下觀察神經(jīng)輕微凹陷但不阻斷坐骨神經(jīng)的血供為宜，術(shù)畢逐層縫合肌肉及皮膚并使用碘伏消毒，單籠飼養(yǎng)。

5.行為學(xué)測(cè)試

觀察所有實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況，包括飲食，生長(zhǎng)，毛發(fā)色澤，記錄大鼠的體重變化。于術(shù)前3天連續(xù)測(cè)定大鼠機(jī)械刺激縮足反射痛閾值 (paw withdrawal mechanical threshold, PWMT) 和熱刺激縮足反射潛伏期 (paw withdrawal thermal latency, PWTL)，取平均值作為術(shù)前基礎(chǔ)值。

6.機(jī)械刺激縮足反射痛閾值測(cè)定(PWMT)

將大鼠置于自制金屬網(wǎng)格籠子(18 cm×8 cm×8 cm)中，待大鼠適應(yīng)環(huán)境，梳理和探究活動(dòng)基本消失、足底伸展適中后，將不同壓力的von Frey纖維絲從底部豎直刺激大鼠右后足底中心持續(xù)6～8 s，緩慢增加壓力，在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開von Frey纖維絲時(shí)大鼠有抬足、縮足、舔足等動(dòng)作視為陽(yáng)性反應(yīng)。按Chaplan等[10]研究的“ up and down ”方法計(jì)算大鼠機(jī)械縮足閾值。每只大鼠測(cè)3次，每次間隔10 min，取平均值。

7.熱刺激縮足反射潛伏期測(cè)定 (PWTL)

設(shè)定智能熱板測(cè)痛儀溫度為52 ℃，待大鼠適應(yīng)周圍環(huán)境后，將大鼠置于熱板儀上，記錄大鼠受刺激出現(xiàn)迅速抬足或舔足的時(shí)間，即為熱痛閾值。每只大鼠重復(fù)3次，每次間隔時(shí)間10 min，取平均值。

8.免疫組化

術(shù)后第14天將大鼠麻醉后固定操作臺(tái)上，仰臥位開胸，暴露大鼠心臟，經(jīng)心尖左心室插管至升主動(dòng)脈進(jìn)行灌注。依次使用4 ℃生理鹽水及4%多聚甲醛各250 ml灌注，灌注完畢后，打開椎板迅速將大鼠脊髓L4-L6節(jié)段取下，置于10%多聚甲醛中固定48 h后石蠟包埋成塊，4 μm連續(xù)切片。分別按照GFAP及SP試劑說明進(jìn)行免疫組化操作，每只大鼠做5張切片。主要步驟為內(nèi)源性過氧化酶的阻斷，熱抗原修復(fù)，分別加入適當(dāng)稀釋一抗(GFAP 1：400，SP 1：400)，4 ℃孵育過夜，加入二抗，DAB顯色并復(fù)染。每張切片在200倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取3個(gè)不同視野觀察，用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定脊髓背角GFAP與SP陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值。

9.統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；重復(fù)測(cè)量的資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組大鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果的比較

S組和P組大鼠生長(zhǎng)及飲食情況良好，毛發(fā)光亮；C組大鼠生長(zhǎng)及飲食較差，但各組大鼠體重比較無明顯差異。C組大鼠出現(xiàn)不同程度的右后肢步態(tài)跛行，后足懸空，右后足外翻及肌肉萎縮等狀態(tài)，P組大鼠上述癥狀明顯減輕。

三組大鼠PWMT和PWTL術(shù)前基礎(chǔ)值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。S組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)PWMT和PWTL與術(shù)前基礎(chǔ)值相比，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CCI模型建立后，C組和P組大鼠術(shù)后PWMT和PWTL均較術(shù)前明顯降低，其中C組于術(shù)后第7 d最為明顯，與S組相比差異顯著 (P＜ 0.05)。P組大鼠經(jīng)普瑞巴林治療后，術(shù)后痛覺過敏逐漸改善，PWMT和PWTL較C組明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見圖1A，圖1B)。

2.脊髓背角GFAP表達(dá)的變化

GFAP免疫組化陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。S組大鼠術(shù)后14天脊髓背角GFAP免疫陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度較低 (0.33±0.02)，而在C組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)增強(qiáng)，染色加深，平均光密度值 (0.57 ± 0.06) 明顯高于S組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05，見圖2A, 2B)；與C組相比，P組大鼠脊髓背角GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)下調(diào)明顯，平均光密度值明顯降低 (0.35±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05，見圖2A, 2B)。

3.脊髓中SP表達(dá)的變化

脊髓SP免疫陽(yáng)性細(xì)胞在光鏡下觀察為胞漿著色，呈棕黃色的粗顆粒纖維。與S組大鼠脊髓SP平均光密度 (0.25±0.02) 表達(dá)相比，C組大鼠脊髓SP平均光密度值 (0.49±0.08) 明顯增高 (P＜ 0.05，見圖3A，3B)；經(jīng)普瑞巴林治療后，P組大鼠脊髓SP平均光密度 (0.29±0.02) 較C組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05，見圖3A, 3B)。

討 論

本實(shí)驗(yàn)采用的CCI模型是神經(jīng)病理性疼痛的國(guó)際通用模型，制備簡(jiǎn)單，對(duì)大鼠的損傷較小[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示術(shù)后CCI組PWMT和PWTL明顯降低，術(shù)后第7 d最為明顯。術(shù)后應(yīng)用普瑞巴林60 mg/kg治療后，CCI模型大鼠的PWMT和PWTL顯著增加，痛覺過敏迅速明顯緩解且大鼠未出現(xiàn)水腫、嗜睡、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、進(jìn)食量減少、腹瀉等不良反應(yīng)。

普瑞巴林作為治療神經(jīng)病理性疼痛的一線藥物，它的治療機(jī)制得到越來越多的關(guān)注和研究。作為GABA受體類似物，普瑞巴林能夠抑制神經(jīng)病理性疼痛中電壓門控鈣離子通道α2δ-1蛋白在脊髓背角的表達(dá)，減少鈣離子內(nèi)流，抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而減輕神經(jīng)損傷后產(chǎn)生的痛覺過敏和自發(fā)性疼痛[11]。研究發(fā)現(xiàn)普瑞巴林鞘內(nèi)給藥可以抑制脊髓背角廣動(dòng)力范圍 (wide dynamic range, WDR)神經(jīng)元，減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛敏反應(yīng)[12]；Gustafsson等給予SNI疼痛模型大鼠普瑞巴林口服后，大鼠的痛覺超敏明顯減輕[13]；另有研究表明普瑞巴林對(duì)該模型大鼠的鎮(zhèn)痛效果和持續(xù)時(shí)間與劑量相關(guān)[14]。在臨床實(shí)驗(yàn)中，大量隨機(jī)，雙盲，對(duì)照研究也顯示了普瑞巴林對(duì)多種中樞性、外周性及癌痛具有良好的鎮(zhèn)痛效果[15,16]，彈性劑量150～600 mg/d（視病情調(diào)整用量）的普瑞巴林能夠有效緩解創(chuàng)傷后神經(jīng)性疼痛，改善睡眠及病人整體狀態(tài)且耐受性良好[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示術(shù)后連續(xù)8天給予大鼠60 mg/kg普瑞巴林灌胃，能夠顯著減輕CCI模型大鼠的痛覺過敏且未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。這與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相一致，支持了普瑞巴林治療神經(jīng)病理性疼痛可靠的有效性和安全性。

圖1 (A)三組大鼠不同時(shí)間機(jī)械刺激縮足反射閾值變化趨勢(shì) (g)S，C，P分別為假手術(shù)組，CCI模型組，普瑞巴林組 *P ＜ 0.05，與S組比較；#P ＜ 0.05，與C組比較(B)三組大鼠不同時(shí)間熱刺激縮足反射潛伏期值變化趨勢(shì) (s) S，C，P分別為假手術(shù)組，CCI模型組，普瑞巴林組*P ＜ 0.05，與S組比較；#P ＜ 0.05，與C組比較Fig.1 (A) Changes of PWMT in three groups at different time points S： sham group, C： CCI model group, P： PGB group *P ＜ 0.05, compared with Group S; #P ＜ 0.05, compared with Group C.S： sham group, C： CCI model group, P： PGB group.(B) Changes of PWTL in three groups at different time points.*P ＜ 0.05, compared with Group S; #P ＜ 0.05, compared with Group C.

圖2 三組大鼠脊髓背角中GFAP表達(dá)的比較S,C,P分別為假手術(shù)組，CCI模型組，普瑞巴林組(A)大鼠脊髓背角GFAP免疫組化圖；(B)大鼠脊髓背角GFAP平均光密度值 *P ＜ 0.05，與S組比較； #P ＜ 0.05，與C組比較Fig.2 The expression of GFAP in the spinal dorsal horn in three groups C： CCI model group, P： PGB group (A) Immunohistochemistrical staining of GFAP in the spinal dorsal horn; (B) Mean optical density of GFAP in the spinal dorsal horn.*P ＜ 0.05, compared with group S; #P ＜ 0.05, compared with group C.S： sham group,

圖3 三組大鼠脊髓背角中P物質(zhì)表達(dá)的比較S，C，P分別為假手術(shù)組，CCI模型組，普瑞巴林組 (A)大鼠脊髓背角P物質(zhì)免疫組化圖；(B)大鼠脊髓背角P物質(zhì)平均光密度值與S組比較，*P ＜ 0.05；與C組比較，#P ＜ 0.05Fig.3 The expression of SP in the spinal dorsal horn in three groups S： sham group, C： CCI model group, P： PGB group.(A) Immunohistochemistrical staining of SP in the spinal dorsal horn; (B) Mean optical density of SP in the spinal dorsal horn.*P ＜ 0.05, compared with group S; #P ＜ 0.05, compared with group C.

為了研究普瑞巴林鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制，我們進(jìn)一步觀察了普瑞巴林對(duì)CCI大鼠脊髓背角GFAP和SP表達(dá)的影響。

當(dāng)外周神經(jīng)損傷后，初級(jí)傳入纖維末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)可以激活脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而可引發(fā)絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，活化ERK、JNK/SAPK、p38通路，導(dǎo)致離子通道表達(dá)水平變化繼而釋放大量細(xì)胞因子如白介素-1β (IL-1β)、白介素-6 (IL-6)和腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 等造成中樞敏化，最終產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛[18]。研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在不同的神經(jīng)病理性疼痛模型中均被激活，而通過給予抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的藥物如氟代檸檬酸等可以明顯減輕這種痛覺過敏現(xiàn)象[19]，這些研究結(jié)果提示星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活在參與調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程中起著非常重要的作用。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，也是目前用來識(shí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞來源應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)志物，其表達(dá)可以間接反映星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的程度。我們發(fā)現(xiàn)術(shù)后14天S組大鼠僅有少量GFAP表達(dá)，行為學(xué)測(cè)試無明顯痛覺過敏出現(xiàn)。而脊神經(jīng)損傷后C組大鼠結(jié)扎側(cè)脊髓背角內(nèi)GFAP陽(yáng)性表達(dá)顯著上調(diào)，痛覺過敏增強(qiáng)，提示脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活參與并維持了外周神經(jīng)損傷性疼痛的發(fā)生過程。連續(xù)8天給予P組大鼠60 mg/kg普瑞巴林后，我們發(fā)現(xiàn)大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角細(xì)胞內(nèi)的GFAP表達(dá)較C組明顯降低，大鼠痛覺過敏程度明顯減輕。

SP主要分布于脊髓后角灰質(zhì)淺層，尤其在傷害性初級(jí)傳入神經(jīng)纖維末梢，被釋放后能與突觸后神經(jīng)元的受體相結(jié)合，參與慢性疼痛在脊髓的傳導(dǎo)和調(diào)制；研究發(fā)現(xiàn)脊髓中的星形膠質(zhì)細(xì)胞在SP的作用下能夠明顯活化并分泌炎性因子TNF-α、IL-1β，而TNF-α除了增強(qiáng)脊髓內(nèi)的炎性反應(yīng)[20]，還可以通過JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生中樞敏化趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1) 再次激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)合成釋放更多的膠質(zhì)介質(zhì)，從而引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提高神經(jīng)元興奮性，導(dǎo)致脊髓水平的中樞敏化，最終產(chǎn)生持續(xù)性疼痛[21]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，C組大鼠神經(jīng)損傷后大鼠PWMT和PWTL明顯下降，脊髓中GFAP表達(dá)上調(diào)，與此同時(shí)脊髓SP表達(dá)也增強(qiáng)，這些結(jié)果提示高表達(dá)的SP參與了神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生與維持；而給予普瑞巴林干預(yù)后，P組大鼠在術(shù)后第14天脊髓背角SP的表達(dá)明顯下降，這種變化與GFAP的表達(dá)變化及行為學(xué)測(cè)試結(jié)果相一致，由此我們推測(cè)普瑞巴林可能通過下調(diào)SP的表達(dá)來進(jìn)一步抑制CCI模型大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而減輕CCI大鼠痛覺過敏，這可能成為普瑞巴林治療神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制之一。但由于神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制廣泛而復(fù)雜，它與脊髓SP、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及離子通道表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的改變有著密不可分的聯(lián)系，普瑞巴林通過哪些具體途徑抑制脊髓背角SP表達(dá)，是否有其它神經(jīng)活性物質(zhì)參與調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞激活仍有待進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)存在一定局限性，并未使用GFAP或SP的抑制劑來進(jìn)一步觀察大鼠痛覺過敏的變化情況，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索和證實(shí)。

綜上所述，普瑞巴林可以顯著抑制CCI模型大鼠的痛覺過敏癥狀，這種鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與下調(diào)脊髓背角SP的表達(dá)從而抑制其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。