脈沖射頻背根神經(jīng)節(jié)對(duì)CCI模型大鼠脊髓中Iba1和TRPV1表達(dá)的影響*

徐雪汝 林星武 傅少雄 施小妹 劉榮國

（福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院 福建省老年病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建省立醫(yī)院疼痛科，福州350001）

神經(jīng)病理性疼痛 (neuropathic pain, NP)[1]是由于軀體感覺系統(tǒng)的損傷或疾病所引起的疼痛，嚴(yán)重影響病人生存質(zhì)量，是醫(yī)學(xué)界亟待解決的重大課題。已知脊髓中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞在NP的產(chǎn)生和傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞的活化能明顯緩解NP[2,3]。瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1是分布于外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的離子通道型受體，脊神經(jīng)損傷后，同側(cè)DRG及脊髓內(nèi)的TRPV1表達(dá)增加[4]。敲除脊髓及DRG中的TRPV1表達(dá)后，可明顯緩解機(jī)械性及熱痛覺過敏[5]。值得注意的是，增強(qiáng) TRPV1表達(dá)可調(diào)控神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的釋放，進(jìn)而激活膠質(zhì)細(xì)胞；而抑制TRPV1的表達(dá)，膠質(zhì)細(xì)胞活化則明顯下降[6]。因此TRPV1在激活小膠質(zhì)細(xì)胞并形成NP中具有重要作用。脈沖射頻作為一種微創(chuàng)技術(shù)被廣泛用于慢性疼痛治療，但PRF的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。TRPV1作為小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元之間痛覺信號(hào)傳遞的關(guān)鍵分子，是否參與PRF的鎮(zhèn)痛機(jī)制未見報(bào)道。本研究擬復(fù)制SD大鼠CCI疼痛模型，并對(duì)CCI大鼠DRG行PRF治療，觀察大鼠疼痛行為改變和脊髓中Iba1、TRPV1的表達(dá)變化，研究 PRF對(duì)CCI大鼠疼痛的調(diào)控作用及其鎮(zhèn)痛機(jī)制，為臨床應(yīng)用PRF治療NP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

清潔級(jí)SD 大鼠100只，體重250～280 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4 組，每組25 只，分別為假手術(shù)組（Sham組）、慢性坐骨神經(jīng)縮窄損傷組（CCI 組）、CCI +PRF處理組（CCI + PRF 組）、CCI + 假PRF處理組（CCI + free-PRF 組）。造模前 (Basal)，CCI后1 d、3 d、5 d、7 d (CCI-1 d、3 d、5 d、7 d)，PRF 后 1、7、14 d (PRF-1 d、7 d、14 d) 四組大鼠均接受行為學(xué)和痛閾測定。于術(shù)前、CCI-7 d、PRF-14 d每組各處死5 只大鼠，采用RT-PCR測定脊髓中Iba1、TRPV1表達(dá)水平。于CCI-7 d、PRF-14 d 采用免疫熒光法測定各組脊髓中Iba1、TRPV1水平。

2.模型制備

（1）慢性坐骨神經(jīng)縮窄損傷(CCI) 模型 按照Bennett[7]的方法制備CCI 模型。大鼠全麻后暴露右坐骨神經(jīng)主干，用4-0 鉻制羊腸線（上海金環(huán)）環(huán)繞坐骨神經(jīng)主干做4 道單結(jié)環(huán)扎，使單結(jié)剛好能沿神經(jīng)上下滑動(dòng)，每個(gè)結(jié)間隔1 mm。Sham組僅暴露右坐骨神經(jīng)。為保證結(jié)扎松緊度一致，本研究采取專人結(jié)扎，由近及遠(yuǎn)，每次均以結(jié)扎側(cè)肢體出現(xiàn)輕微抽動(dòng)，術(shù)側(cè)后爪不堪重負(fù)，足趾并攏輕度外翻、自發(fā)性的縮足反射等現(xiàn)象。

（2）脈沖射頻DRG治療模型 于CCI 后第7 d，暴露右側(cè)L4-5DRG，將射頻儀 (Cosman RF-G4 ，美國) 的負(fù)極板貼于大鼠足底，22G 射頻治療套管針（Cosman RF-G4，美國）置于DRG上，取出針芯，插入電極，連接射頻儀，設(shè)定模式：脈寬20 ms、脈沖頻率2 Hz，溫度42℃，持續(xù)6 min。CCI + free-PRF 組：造模后第7 d，于右側(cè)L4-5DRG放置射頻電極，無脈沖射頻治療，持續(xù)6 min。術(shù)中肛溫維持在37～37.5 ℃，于麻醉恢復(fù)期間，腹腔內(nèi)注射5 ml 無菌生理鹽水維持血容量。

3.疼痛行為學(xué)觀察和測量

在造模前測定各組大鼠基礎(chǔ)痛閾值，造模后1 d、3 d、5 d、7 d，PRF 后 1、7、14 d 進(jìn)行疼痛行為學(xué)測定。所有測定均在8：00～12：00 am安靜環(huán)境下進(jìn)行。

（1）機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT) 測量 按照 Chaplan SR 等[8]的方法，用Von Frey 纖維（Stoelting公司，美國）以u(píng)p and down 法測定MWT，將一有機(jī)玻璃箱置于金屬篩網(wǎng)上，大鼠適應(yīng)10 min 后，以Von Frey 針絲垂直刺激大鼠術(shù)側(cè)后足掌部，避開爪墊，持續(xù)時(shí)間≤ 4 s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。測定首先從2 g 開始，當(dāng)該力度刺激不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級(jí)力度刺激；如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級(jí)力度刺激，如此連續(xù)進(jìn)行，直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)，再連續(xù)測定4 次，取平均值為閾值。最大力度為15 g，大于此值時(shí)記為15 g。每次刺激間隔30 s，每次測量時(shí)使尼龍絲彎曲到相同的弧度，以確保每次施加的刺激相同。

（2）熱輻射刺激縮爪反應(yīng)潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL) 測量 按照Hargreaves等[9]的方法將動(dòng)物放在6 mm 厚有機(jī)玻璃板上，將PL-200 型全自動(dòng)熱痛刺激儀（成都泰盟科技有限公司）光源焦距通過有機(jī)玻璃板照射動(dòng)物后肢足底掌心，電子秒表記錄從照射開始到引起后肢回縮反應(yīng)時(shí)的潛伏期作為熱痛覺觀測指標(biāo)。讀數(shù)精確到0.01 s。取每只大鼠5 次測量結(jié)果的均值為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，測量間隔時(shí)間為5 min。事先調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，使平均潛伏期約10 s。上限為20 s，以免造成組織損傷。

4.RT-PCR法測定Iba1、TRPV1的表達(dá)

取L4-5段脊髓，置于液氮中保存。利用Trizol提取組織總mRNA，按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，目的基因是TRPV1、Iba1，內(nèi)參基因是β-actin。RT-PCR反應(yīng)體系組成如下：cDNA 模板2 L、上下游引物各0.5 μl、1 U Taq 聚 合 酶、2 L 2.5 mmol/L dNTP 和2.5 L 10 × PCR 緩沖液，加超純水至總體積25 L。反轉(zhuǎn)錄條件如下：37℃ 15 min，85℃ 5 s；冰上冷卻，cDNA 產(chǎn)物-20℃凍存。擴(kuò)增條件如下：95℃ 30 s，總共40 循環(huán)，95℃變性5 s，60℃退火20 s。每組都重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。各目的基因引物序列如下：Iba1：forward 5'-GCAAGGATTTGCAGGGAGGA-3'，reverse 5'-TGGGATCATCGAGGAAGTGC-3'；TRPV1：forward GAGTGCCGACACCTATCCAG，reverse CGATCACCTCCAGAACCGAG；β-actin：forward 5'-ACTCTGTGTGGATTGGTGGC-3'，reverse 5'-AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3' 。

5.免疫熒光染色法檢測Iba1、TRPV1的表達(dá)

大鼠腹腔麻醉，開胸經(jīng)心臟灌注4% 多聚甲醛。取L4-5段脊髓，并用刀片在非手術(shù)側(cè)劃一缺口作為標(biāo)記，多聚甲醛固定12 h，樣本置于石蠟中包埋，切片，片厚5 μm。采用等距隨機(jī)抽樣法，抽取5 張用于免疫熒光染色。脫蠟，3%過氧化氫室溫下孵育10 min，0.1 mol/L 枸櫞酸緩沖液微波修復(fù)10 min，冷卻至室溫，依次加入3% 血清工作液封閉10 min 后，甩掉封閉液，直接加入一抗：兔抗鼠Iba1 抗體（ab178680，abcam，英國），兔抗鼠TRPV1抗體 （ab74855，abcam，英國），1：300，4℃孵育過夜，滴加羊抗兔二抗IgG （1：5 000，Thermo 公司，美國），室溫孵育30 min，PBS 沖洗3次，抗熒光淬滅封片液封片，Olympus 光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）觀察。陰性對(duì)照以PBS 代替一抗，余步驟相同。

6.統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值、熱輻射刺激縮爪反應(yīng)潛伏期采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行組間各時(shí)間點(diǎn)的比較。Iba1、TRPV1 的表達(dá)量采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。

結(jié) 果

1.MWT和TWL測定比較

（1）各組MWT的比較：術(shù)前各組間比較及Sham組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCI組、CCI + PRF組、CCI + free-PRF組均于CCI-7 d MWT降至最低，且三組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脈沖射頻后，CCI + PRF組MWT從2.69 ± 0.28 g(CCI-7 d) 上升至 6.96 ± 0.38 g (PRF-14 d)，顯著高于CCI組和CCI + free-PRF組(P＜ 0.05)，但仍低于Sham組（P＜ 0.05，見圖1A）。

（2）各組TWL的比較：術(shù)前各組間比較及Sham組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCI組、CCI + PRF組、CCI + free-PRF組均于CCI-7 d降至最低，且三組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脈沖射頻后，CCI + PRF組TWL從4.26 ± 0.08 s (CCI-7 d)上升至7.09 ± 0.34 s (PRF-14 d)，顯著高于CCI組和CCI + free-PRF組(P＜ 0.05)，但仍低于Sham組（P＜ 0.05，見圖1B）。

2.RT-PCR法檢測Iba1、TRPV1 mRNA水平

術(shù)前、CCI-7 d、PRF-14 d測定各組Iba1、TRPV1 mRNA表達(dá)水平。術(shù)前各組Iba1、TRPV1 mRNA 均低水平表達(dá)。CCI-7 d，與Sham組比較CCI組、CCI + free-PRF組、CCI + PRF組表達(dá)顯著增加(P＜ 0.05)， 但 CCI組、CCI + free-PRF組、CCI +PRF組之間兩兩比較無顯著性差異。于PRF-14 d，CCI + PRF組Iba1、TRPV1 mRNA表達(dá)均比射頻治療前(CCI-7 d)顯著降低(P＜ 0.05)，并低于CCI組和CCI + free-PRF組(P＜ 0.05)，但仍高于Sham組（P＜ 0.05，見圖2）。

3.免疫熒光法檢測Iba1、TRPV1的表達(dá)

Sham組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)大鼠脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞胞體小、熒光表達(dá)強(qiáng)度弱。CCI-7 d， CCI組、CCI +free-PRF組、CCI + PRF組，小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)，胞體增大，形態(tài)清楚，形態(tài)呈“豐滿”狀，Iba1、TRPV1蛋白免疫反應(yīng)熒光密度值與Sham組比較顯著增強(qiáng)(P＜ 0.05)，但三組兩兩比較，無顯著性差異。PRF-14 d，CCI + PRF組 Iba1、TRPV1蛋白免疫反應(yīng)熒光密度值顯著低于CCI組和CCI + free-PRF組 (P＜ 0.05)，但仍顯著高于 Sham 組 (P＜ 0.05)。CCI + PRF組 PRF-14 d與 CCI-7 d比 較，Iba1、TRPV1蛋白免疫反應(yīng)熒光密度值明顯減少（P＜ 0.05，見圖3、4）。

圖1 四組術(shù)側(cè)MWT (A)和TWL (B)比較(±SD)*P ＜ 0.05，與 Sham 組比較；#P ＜ 0.05，與CCI組、CCI + free-PRF組比較；△P ＜ 0.05，與CCI + PRF組內(nèi)的CCI-7 d比較Fig.1 The comparison of MWT (A) and TWL (B) in ipsilateral paw among four groups (±SD)*P ＜ 0.05, compared with those in group Sham; #P ＜ 0.05, compared with those in group CCI and CCI + free-PRF;△P ＜ 0.05, compared with that on CCI-7 d in CCI + PRF group.

圖2 各組大鼠脊髓Iba1、TRPV1 mRNA 表達(dá)比較(±SD)*P ＜ 0.05，與Sham組比較；#P ＜ 0.05，CCI + PRF組中 PRF-14 d與CCI-7 d比較；△P ＜ 0.05，與CCI組、CCI + free-PRF組比較Fig.2 The comparisons of Iba1、TRPV1 mRNA expressions among different groups (±SD)*P ＜ 0.05, compared with those in group Sham; #P ＜ 0.05, PRF-14 d data compared with CCI-7 d data in group CCI + PRF; △P ＜ 0.05, compared with those in group CCI and CCI + free-PRF.

圖3 各組大鼠脊髓Iba1, TRPV1表達(dá)比較（免疫熒光法，×100） Scale bar = 200 μmFig.3 Expressions of Iba1, TRPV1 in the spinal cord of rats in different groups (immunofluorescence, × 100) Scale bar = 200 μm

圖4 免疫熒光法檢測各組大鼠脊髓中Iba1、TRPV1的表達(dá)(±SD)*P ＜ 0.05，與Sham組比較；#P ＜ 0.05，CCI + PRF組中PRF-14 d與CCI-7 d比較；△P ＜ 0.05，與CCI組、CCI +free-PRF組比較Fig.4 The comparisons of Iba1, TRPV1 expressions among different groups in immunofluorescence (±SD)*P ＜ 0.05, compared with those in group Sham; #P ＜ 0.05, PRF-14 d data compared with CCI-7 d data in group CCI +PRF; △P ＜ 0.05, compared with those in group CCI and CCI + free-PRF.

討 論

本研究選用的是 SD大鼠CCI模型，對(duì)坐骨神經(jīng)主干輕度結(jié)扎，選擇性損傷有髓鞘的神經(jīng)纖維，保留大部分具有傳遞疼痛作用的C類纖維，可以很好地模擬出人類臨床常見慢性疼痛的癥狀[10]。大鼠CCI模型建立后第1 天即出現(xiàn)術(shù)側(cè)足趾外翻，下肢軟弱無力，不堪重負(fù)，行走緩慢，后足翻起部分觸碰地面，會(huì)立即主動(dòng)撤回該足，并發(fā)生自發(fā)性縮足動(dòng)作。造模后第1天術(shù)側(cè)后爪開始出現(xiàn)疼痛反應(yīng)，MWT 和TWL與假手術(shù)組相比明顯降低，CCI-7 d達(dá)高峰并在隨后觀察時(shí)間內(nèi)維持穩(wěn)定，而假手術(shù)組各時(shí)點(diǎn)MWT 和TWL 無顯著性變化，表明NP模型成功。本實(shí)驗(yàn)的疼痛行為學(xué)改變也曾于筆者之前的研究所證實(shí)[11,12]。

NP的發(fā)生機(jī)制涉及外周敏化和中樞敏化。當(dāng)外周組織損傷后，機(jī)體產(chǎn)生、釋放炎癥介質(zhì)，直接或間接作用于傷害性感受器，傷害性感受信息沿著傳入神經(jīng)匯集于假單極神經(jīng)元DRG中，DRG將匯聚的痛、溫、觸等各種信息整合，經(jīng)脊髓背角、腦干和丘腦向上傳遞，最終在大腦皮層形成痛覺。脊髓是疼痛信息傳遞和整合的初級(jí)中樞，在中樞敏化中發(fā)揮重要作用，因此我們選擇脊髓節(jié)段作為研究觀察的切入點(diǎn)?，F(xiàn)已證實(shí)，當(dāng)外周神經(jīng)損傷后，脊髓背角接收異常興奮的初級(jí)感覺神經(jīng)元信號(hào)，引起脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞肥大、增殖以及相關(guān)基因表達(dá)等一系列改變，由靜息態(tài)的分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)阿米巴狀后釋放多種生物活性物質(zhì)，使神經(jīng)元- 膠質(zhì)細(xì)胞以及膠質(zhì)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞之間建立起雙向信息交流通路，從而形成NP，而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及其活性物質(zhì)的釋放可明顯減輕疼痛[13,14]。本研究Sham組中各時(shí)間點(diǎn)大鼠脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞胞體小、熒光強(qiáng)度弱。CCI損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，形態(tài)清楚，形態(tài)呈“豐滿”狀，Iba1（小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體）免疫熒光強(qiáng)度及Iba1 mRNA表達(dá)亦明顯升高，同時(shí)伴隨著機(jī)械痛和熱痛的出現(xiàn)，以上結(jié)果提示，本研究中脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞參與了NP的形成，這與Masuda等[15]的研究結(jié)果一致。

瞬時(shí)感受器電位受體(TRPV1)，是一種配體門控的非選擇性陽離子通道，對(duì)多種有害的化學(xué)和熱刺激敏感，炎性物質(zhì)激活TRPV1后引起大量Ca2+內(nèi)流，并觸發(fā)外周感覺神經(jīng)末梢釋放大量炎性介質(zhì)，從而加劇疼痛。TRPV1除了在炎癥性疼痛中發(fā)揮重要作用外，還參與了NP的痛覺敏化。研究發(fā)現(xiàn)，在完全弗氏佐劑所致的炎性痛模型[16]、SNI所致的NP模型[2]中TRPV1表達(dá)均明顯上升；在大鼠糖尿病性NP模型中DRG、脊髓背角、皮膚端TRPV1水平均于造模后7 d開始上升，14 d達(dá)到頂峰，28 d恢復(fù)正常水平[17]。因此，TRPV1參與多種疼痛的傳導(dǎo)過程。本研究造模前脊髓中TRPV1 呈低水平表達(dá)，CCI后TRPV1表達(dá)顯著增加，并于損傷后21 d的觀察期內(nèi)維持高水平，這與上述研究結(jié)果相似，再次證明了TRPV1參與了NP 的形成。目前，已知位于感覺傳入系統(tǒng)中的TRPV1可調(diào)控神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的釋放，如谷氨酸、脊髓背角中的降鈣素基因相關(guān)肽，進(jìn)而激活膠質(zhì)細(xì)胞。而Chen 等發(fā)現(xiàn)足底注射辣椒素、完全弗氏佐劑注射、坐骨神經(jīng)結(jié)扎的小鼠脊髓中Iba1明顯升高，在TRPV1基因敲除的小鼠中Iba1則明顯下降，提示在傷害性、神經(jīng)病理性、炎癥性疼痛中TRPV1對(duì)于激活脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮重要作用[18]。因此，抑制TRPV1表達(dá)可減少小膠質(zhì)細(xì)胞激活，從而阻斷NP的發(fā)生、發(fā)展。

臨床上對(duì)于頑固性NP的治療，口服藥物療效欠佳，而神經(jīng)毀損、外科干預(yù)等可導(dǎo)致不可逆并發(fā)癥。PRF作為一種有效的疼痛治療手段已被廣泛用于NP治療。對(duì)于PRF的鎮(zhèn)痛機(jī)制，有研究認(rèn)為，PRF可選擇性引起細(xì)胞形態(tài)、突觸傳遞和疼痛信號(hào)的改變來實(shí)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)控。例如，Van Zundert等[19]發(fā)現(xiàn)，PRF治療后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脊髓背角淺表I和II板層中，c-fos的免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元明顯升高。Vallejo等[20]在坐骨神經(jīng)損傷附近應(yīng)用PRF，發(fā)現(xiàn)可調(diào)節(jié)痛覺傳導(dǎo)通路上疼痛基因的表達(dá)，減少損傷側(cè)坐骨神經(jīng)、DRG促炎基因的表達(dá)，如TNF-α和IL-6。亦可上調(diào)DRG中γ-氨基丁酸受體、Na/K-ATP酶、5-羥色胺Ⅲ受體，脊髓c-fos、Na/K-ATP酶的表達(dá)。由于NP的發(fā)生機(jī)制牽涉到極其復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，上述研究遠(yuǎn)未窮盡PRF的鎮(zhèn)痛機(jī)制。最近研究發(fā)現(xiàn)，NP大鼠DRG實(shí)施PRF治療后，大鼠的機(jī)械痛敏減輕，同時(shí)脊髓背角內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化降低。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，PRF可以明顯減輕CCI 模型的機(jī)械異常痛敏、熱痛敏，并在治療后14天的觀察期維持穩(wěn)定[11]。鑒于疼痛模型中TRPV1對(duì)于激活脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮重要作用，遏制TRPV1表達(dá)可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活并緩解慢性疼痛。由于PRF可降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化而緩解疼痛，因此PRF 的作用機(jī)制可能與TRPV1的改變有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)：①大鼠CCI后第7 d于DRG實(shí)施 PRF治療，射頻后第1天即開始出現(xiàn)機(jī)械痛閾和熱痛閾的回升，至治療后第7 d、14 d均持續(xù)升高，提示單次PRF治療可抑制致痛物質(zhì)的釋放及正反饋信號(hào)形成，因此在停止治療后仍有持續(xù)調(diào)控鎮(zhèn)痛作用，但閾值未恢復(fù)至正常水平。這也說明，本實(shí)驗(yàn)中的PRF（脈寬20 ms、脈沖頻率2 Hz，溫度42℃，持續(xù)6 min）模式不能夠完全逆轉(zhuǎn)和治療NP，如果要進(jìn)一步提升療效，可嘗試改變PRF的參數(shù)設(shè)置、在中樞敏化形成之前治療、或者復(fù)合小劑量的鎮(zhèn)痛藥物等。②CCI后大鼠脊髓內(nèi)Iba1、TRPV1表達(dá)程度較CCI前均顯著增強(qiáng)，而PRF治療后兩者表達(dá)顯著減弱，但仍強(qiáng)于Sham組，同時(shí)伴隨著痛閾的提高。以上結(jié)果表明，在CCI模型中脊髓TRPV1表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞活化增加，PRF治療有可能抑制CCI大鼠脊髓中TRPV1的表達(dá)而減輕小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而緩解疼痛。

本研究的不足之處是僅短時(shí)間觀察（14天）PRF的鎮(zhèn)痛作用；論證了PRF能夠抑制脊髓內(nèi)TRPV1和小膠質(zhì)細(xì)胞活化而緩解疼痛，但未做TRPV1免疫雙標(biāo)，不能確定TRPV1表達(dá)于何種細(xì)胞等等，更多具體細(xì)節(jié)仍需后續(xù)深入研究。

綜上所述，PRF大鼠CCI模型DRG可下調(diào)脊髓內(nèi)TRPV1的表達(dá)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而減輕NP，這為臨床應(yīng)用PRF治療慢性疼痛再次提供了理論支持依據(jù)。