偽狂犬實時熒光定量PCR檢測方法的建立

劉國英，商曉桂，范秀麗，張貴剛，郝鵬，閆聰，韓志玲

（金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010030）

0 引言

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（PseudorabiesVirus，PRV）引起的B類傳染病[1]（OIE認定），分布廣泛，危害嚴重，可以感染不同年齡段的豬，但以妊娠母豬和哺乳仔豬感染最為嚴重。該病導致妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎；哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭死亡[2]，死亡率幾乎高達100%。目前PR已成為對全球養(yǎng)豬業(yè)危害最大的傳染病之一，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

偽狂犬病毒又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，屬于皰疹病毒科中的α皰疹病毒亞科，基因組為雙鏈DNA分子，大小約150 kb，成熟病粒子攜帶50余種蛋白[3]。gE、gG、gI、TK等毒力基因是其復制非必需基因，其編碼的蛋白為非必需糖蛋白，缺失這些基因后，其復制擴增及抗原性并不受任何影響，但毒力卻降低，其中gE基因是偽狂犬的主要毒力相關基因，也是世界動物衛(wèi)生組織所規(guī)定基因缺失疫苗的首選缺失基因[4]。目前，歐美等發(fā)達資本主義國家應用gE基因缺失疫苗及其配套的鑒別診斷方法已實現(xiàn)了偽狂犬的凈化，中國也已廣泛使用gE基因缺失弱毒疫苗用于偽狂犬的預防和控制。gB基因為偽狂犬病毒復制所必需的基因，在野毒株與基因缺失株中均存在[5]，因此可以通過對gB基因和gE基因進行檢測，區(qū)分所感染偽狂犬病毒的類型。

目前，國內外常用的實驗室診斷偽狂犬病毒的方法主要包括病毒分離、兔體接種試驗、抗體診斷、病原學診斷、分子生物學診斷等幾大類，其中分子生物學診斷中的熒光定量PCR檢測技術以其快速、簡便、準確等優(yōu)點成為快速發(fā)展的檢測手段。該發(fā)明通過建立針對gB基因和gE基因的雙重熒光定量PCR方法，能快速鑒別偽狂犬病野毒株與基因缺失株，并對病毒拷貝數(shù)進行精確定量[6-7]，為偽狂犬病毒的快速診斷提供科學依據(jù)，也對偽狂犬疫苗的生產(chǎn)具有指導作用，同時對于疫病的控制和凈化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

偽狂犬病毒樣品為實驗室的偽狂犬弱毒株與強毒株細胞培養(yǎng)物、偽狂犬弱毒株細胞培養(yǎng)物濃縮樣品、病料等；陽性對照為偽狂犬弱毒株細胞培養(yǎng)物。

1.1.2 試劑

PCR 4-TOPO載體、Easy Dilution、X-gal、IPTG、Amp+、6*loading buffer、T4 DNA連接酶、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、DNA Marker、Ex Taq聚合酶、限制性內切酶、DNAzol試劑、柱式質粒小量抽提試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等。

1.1.3 儀器

熒光定量PCR儀、高速臺式冷凍離心機、電泳系統(tǒng)、凝膠成像儀、核酸蛋白檢測儀、低溫高速離心機等。

1.2 實時熒光定量PCR方法的建立

1.2.1 引物與探針設計

對GenBank中的偽狂犬病病毒gB基因和gE基因的DNA序列進行比對，選取gB、gE基因高度保守且具有特異性的序列，設計Taqman探針和引物。gB基因上游引物為：GGATCTCGCTGTAGTCCAGGAG；下游引物為：GAGGTGCCCGAGACGATCAG；探針序列為：（FAM）TGACCCTGAACCTGACGCTGCTGGA（TAMRA），擴增片段長度為133 bp。gE基因上游引物為：CTCGTGATGACCCACAAAGG；下游引物為：CTTGATGACCGTGACGTACTC；探針序列為：（ROX）CGCCACCTGGGACTACACGCT（BHQ2），擴增片段長度為84 bp。引物和探針序列由TaKaLa公司合成。

1.2.2 陽性標準品的制備

在偽狂犬病病毒gB基因和gE基因的保守區(qū)域分別設計包含熒光定量PCR擴增片段的引物，用于標準品制備，gB基因上游引物為：GGACAGGAAGGACACCAT；下游引物為：CTACGAGGACTACAACTACG，擴增片段長度為364 bp。gE基因上游引物為：GACGACGATGACCTCAA；下游引物為：CTCCTTGATGACCGTGAC，擴增長度為990 bp。引物序列均由TaKaLa公司合成。將純化回收的含有偽狂犬病毒gB基因和gE基因目的片段分別克隆至pGEM-T載體中，構建成重組質粒，用Nanodrop測定濃度，計算gB基因和gE基因標準品的拷貝數(shù)分別為：2.7×1010copies/μL，2.1×1010copies/μL，按照比例用無酶水對DNA標準品進行稀釋，使拷貝數(shù)為1×1010copies/μL，按每管20 μL進行分裝。

1.2.3 雙重熒光定量PCR反應體系和反應條件的建立

雙重熒光定量PCR反應的體系為：Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5 μL，gB基因和gE基因上下游引物各0.5 μL，探針各1 μL，DNA模板2 μL，無酶水6.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，45個循環(huán)，4 ℃保存。

1.2.4 雙重熒光定量PCR標準曲線的建立

取gB基因和gE基因標準品用無酶水做10倍梯度稀釋，使模板濃度為1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL，每個樣品2個重復，以各標準品的濃度log值（X軸）對其相應CT值（Y軸）作圖，繪制標準曲線。

1.2.5 靈敏性驗證

以偽狂犬gB基因和gE基因拷貝數(shù)為1×101～1×108copies/μL的DNA標準品為模板，通過雙重熒光定量PCR檢測拷貝數(shù)梯度的擴增情況，并將熒光定量產(chǎn)物進行電泳，以比較熒光定量方法和普通PCR檢測方法的靈敏性。

1.2.6 重復性驗證

（1）組內重復性驗證。

隨機選取6支偽狂犬病毒細胞培養(yǎng)物，用DNAzol提取DNA后，利用建立好的雙重熒光定量檢測方法對樣品進行熒光定量檢測，每個樣品各做5次重復。對各樣品的CT值計算平均數(shù)和標準偏差，驗證組內重復性。

（2）組間重復性驗證。

隨機選取10支偽狂犬病毒細胞培養(yǎng)物，用DNAzol提取DNA后，利用建立好的標準曲線分別進行5次熒光定量PCR檢測，每次每個樣品各做2個重復，對5次試驗結果的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，驗證建立體系的組內重復性。

1.2.7 特異性驗證

分別用DNAzol對偽狂犬、豬瘟、BVD、IBR、羊口瘡等病毒培養(yǎng)物提取DNA，以水為陰性對照，進行熒光定量PCR檢測，驗證所建立的偽狂犬雙重熒光定量PCR反應體系是否具有特異性。

1.2.8 臨床樣品檢測

利用已建立的偽狂犬雙重熒光定量PCR反應體系對12份臨床疑似血清病料進行檢測，以水為陰性對照，以滅活的豬偽狂犬病野毒株細胞培養(yǎng)物和基因缺失株細胞培養(yǎng)物為陽性對照，對試驗樣品和對照樣品用DNAzol提取核酸DNA后進行熒光定量檢測，樣品及標準品均各做2個重復。

2 結果

2.1 雙重熒光定量標準曲線的建立

對拷貝數(shù)均為1×101～1×108copies/μL的偽狂犬病毒gB和gE基因標準品做熒光定量PCR擴增，gB擴增曲線和標準曲線分別見圖1、圖2；gE擴增曲線和標準曲線分別見圖3、圖4。由圖1、圖3可知2種標準品擴增曲線均為平滑的“S”形曲線，各稀釋梯度之間相差約3個CT值，且gB基因標準曲線方程為y=－0.998x+37.806，相關系數(shù)R2=0.998，gE基因標準曲線方程為y=－0.993x+42.716，相關系數(shù)R2=0.993，說明擴增體系較好，雙重熒光定量PCR標準曲線構建成功。

圖1 gB擴增曲線

圖2 gB標準曲線

圖3 gE擴增曲線

圖4 gE標準曲線

2.2 靈敏性驗證

由圖5電泳檢測可知，雙重熒光定量PCR體系可以檢測到病毒的最小拷貝數(shù)為102/μL，而普通PCR方法電泳檢測僅能檢測到拷貝數(shù)為103/μL的結果，說明熒光定量方法的靈敏度較高。

圖5 不同拷貝數(shù)熒光定量結果電泳檢測

2.3 重復性驗證

2.3.1 組內重復性試驗

隨機選取6支偽狂犬病毒細胞培養(yǎng)物進行熒光定量檢測，每個樣品各做5個重復。計算各樣品CT值的平均數(shù)和標準偏差，如表1所示，各樣品的5次重復性試驗之間的離散度較小，重復性好，滿足試驗要求。

表1 組內重復性試驗結果

2.3.2 組間重復性試驗

隨機選取10支偽狂犬病毒細胞培養(yǎng)物，利用建立好的標準曲線分別進行5次熒光定量PCR檢測，每次每個樣品各做2個重復，對5次試驗結果的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，見表2，各組樣品離散度較小，說明重復性較好。

表2 組間重復性試驗結果

2.4 特異性驗證

利用雙重熒光定量PCR檢測方法對偽狂犬、豬瘟、BVD、IBR、羊口瘡等病毒進行檢測，由擴增曲線可知，僅偽狂犬病毒有雙重熒光曲線，其余病毒CT值均大于38，判定結果為陰性，說明所建立的雙重熒光定量PCR體系特異性好，可以用于病毒鑒定，見圖6。

圖6 雙重熒光定量PCR特異性試驗結果

2.5 雙重熒光定量PCR對樣品的檢測

所檢測的12份疑似血清中有2份血清判定為陰性（不含gB基因和gE基因，即未感染豬偽狂犬病毒），10份血清判定為陽性（感染豬偽狂犬病毒），其中4份血清為豬偽狂犬病野毒株感染（含gB基因和gE基因），6份血清為豬偽狂犬病基因缺失株感染（僅含gB基因，缺失gE基因）。檢測結果見表3。

表3 疑似血清病料的雙重實時熒光定量PCR檢測結果

3 結束語

目前國際上對偽狂犬病的防治措施以疫苗免疫為主，但常規(guī)的血清學方法無法區(qū)分野毒感染和疫苗免疫動物[8]，對偽狂犬病的防治及后期的凈化帶來不便。該研究建立了針對偽狂犬病毒gB基因和gE基因的雙重實時熒光定量PCR方法，能快速鑒別偽狂犬病野毒株（同時含有gB基因和gE基因）與基因缺失株（僅含有gB基因），并且靈敏度高，可以檢測到拷貝數(shù)為102/μL的病毒粒子。同時，檢測方法操作簡便、特異性強，可以在3～4 h內對疑似樣本作出診斷，且不會受到其他病原干擾。該研究建立的方法為豬偽狂犬病毒的早期診斷、感染毒株鑒定及流行病學調查提供了一種重要的技術手段，對于防治該種疾病具有重要意義。