聯(lián)用凝膠色譜凈化和超高效液相色譜定量分析植物油中的苯并芘

房 芳 寧 暉 邵亮亮 杜京霖 高夢莎 趙美鳳

(浙江省糧油產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，杭州 310012)

苯并芘［benzo(a)pyrene，B(a)P］是一種五環(huán)芳香烴類化合物，簡稱3，4－苯并芘，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1。1933年，英國學(xué)者從煤焦油中分離出苯并芘，并誘發(fā)了小鼠皮膚癌，使B［a］P成為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的化學(xué)致癌物［1－2］。我國對環(huán)境及食品中苯并芘的限量標(biāo)準(zhǔn)分別為空氣質(zhì)量日平均濃度小于0.001 μg/m3、生活飲用水小于 0.01 μg/L;肉制品、熏烤動物性食品及糧食小于 5.0 μg/kg、植物油小于 10 μg/kg［3－4］。食品中的苯并芘的主要來源包括:熏烤食品，大氣灰塵和顆粒的沉降，油料的加工過程中炒制溫度過高熱解產(chǎn)生苯并芘［5］。

目前國內(nèi)外關(guān)于苯并芘的常規(guī)檢測方法有:熒光分光光度法［6］、薄層層析法、高效液相色譜法［7］、氣相色譜－質(zhì)譜(Gas Chromatography－Mass Spectrometer，GC －MS)聯(lián)用法［8］等。由于苯并芘具有較強(qiáng)的親油性，因此在糧油檢測中，植物油中的苯并芘檢測意義重大。食用油中苯并芘的檢測分為樣品的預(yù)處理和檢測兩個(gè)基本過程。由于食用油中的苯并芘含量少、穩(wěn)定性差、在油中易吸附，且存在多種潛在干擾物質(zhì):如大量甘油三酯、脂肪物質(zhì)等，降低了后續(xù)分析儀器的靈敏度，從而影響最終的分析結(jié)果，因此對樣品的前處理要求很高。我國檢測食用油中苯并芘主要采用國標(biāo)(GB 5009.27—2016)［9］，前處理分為兩種:一種采用中性氧化鋁柱凈化另一種采用苯并(a)芘分子印跡柱。這兩種前處理方法都存在處理復(fù)雜、耗時(shí)長、試劑耗費(fèi)量大、對人員要求高等問題，因此建立一種準(zhǔn)確、簡便、快速的前處理方法可以更好的為苯并芘定量定性工作提供重要的基礎(chǔ)保障。凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)是利用多孔的凝膠聚合物將化合物按分子空間結(jié)構(gòu)差異(分子質(zhì)量大小)進(jìn)行選擇性分離，不能進(jìn)入凝膠孔隙的分子會很快隨流動相洗脫，而能夠進(jìn)入凝膠孔隙的分子，則需要更長的沖洗時(shí)間才能夠流出固定相，從而實(shí)現(xiàn)對不同組分的分離［10］。利用這個(gè)原理，油脂中的苯并芘檢測完全可以用凝膠色譜串聯(lián)液相色譜完成，由于儀器的全自動化，大大減輕了填柱，過柱等人工勞動，且回收率也可達(dá)到90%以上。此外在檢測過程中引入了超高效液相色譜，相較與高效液相色譜，靈敏度更高，出峰時(shí)間更快，大大提高了檢測效率。

本研究擬在國標(biāo)GB 5009.27—2016的基礎(chǔ)上優(yōu)化，建立一種植物油中定量檢測苯并芘的方法，通過凝膠色譜對植物油樣品進(jìn)行凈化，采用超高效液相色譜檢測。并且按照歐盟2002/657/EC法規(guī)［11］標(biāo)準(zhǔn)對該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。應(yīng)用該方法，可以實(shí)現(xiàn)植物油中的苯并芘半自動化檢測，降低人工操作壓力，提高檢測通量;此外，還可以降低由人工操作引入的不確定度，提高檢測精度。該方法的建立對常規(guī)實(shí)驗(yàn)室有不可忽視的積極意義。

圖1 苯并芘分子結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

1290Infinity超高效液相色譜儀:美國安捷倫公司;Freestyle凝膠色譜:LCTech GmbH公司。

1.1.2 試劑

環(huán)己烷、乙酸乙酯［色譜純，天地(TIDIA)公司，美國］;乙腈(色譜純，默克公司，德國)，苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品(濃度20 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理?xiàng)l件

準(zhǔn)確稱取0.8 g油樣加入10 mL乙酸乙酯和環(huán)己烷(1∶1，V∶V)混合溶液，取6.4 mL 上述溶液采用凝膠色譜凈化。

凝膠色譜條件:色譜柱填料:Bio Beads s－X3聚乙烯凝膠填料;流速:4.5 mL/min;進(jìn)樣量:滿環(huán)進(jìn)樣6.4 mL;淋洗液:乙酸乙酯和環(huán)己烷混合溶液(1∶1，V∶V);淋洗程序:前淋洗時(shí)間12 min，收集時(shí)間15 min，后沖洗時(shí)間10 min;收集的溶液在濃縮腔中進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換，最后用1.5 mL乙腈定容。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱:Aglient Eclipse Plus C18(RRHD 1.8 μm 2.1 mm ×50 mm)帶保護(hù)柱;流速0.1 mL/min;柱溫30℃;流動相∶甲醇∶水(95∶5，V∶V);進(jìn)樣量:10 μL;檢測器:熒光檢測器，激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確吸取0.5 mL苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈定容至10 mL容量瓶，得苯并芘標(biāo)準(zhǔn)中間液(1.0 μg/mL)，把苯并芘標(biāo)準(zhǔn)中間液(1.0 μg/mL)用乙腈稀釋得到 0.5、1、5、10、20、40 ng/mL 的校準(zhǔn)曲線溶液，按照1.2所述方法進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠色譜條件的確定

樣品通過凝膠色譜凈化，主要目的是將目標(biāo)被測物與雜質(zhì)分離開，提高檢測的準(zhǔn)確度和精密度。由于苯并芘在紫外沒有特征波長，因此不能用過凝膠色譜－紫外在線分析確定收集時(shí)間。為了確定苯并芘的確切收集時(shí)間，采用分段收集的方法。由于油脂分子質(zhì)量比較大，主要分布在前7 min的洗脫液中。在此之后，每4 min收集一管餾分，一直收集至35 min，共收集7管。收集的洗脫液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中蒸發(fā)至干后準(zhǔn)確加入1.5 mL乙腈，混合1 min，過 0.45 μm 膜，濾液按 1.2.2 的液相色譜條件進(jìn)行檢測。通過結(jié)果分析(圖2)，得到15－35 min的樣液中含有苯并芘，因此確定收集時(shí)間為12－27 min。

圖2 優(yōu)化凝膠色譜洗脫時(shí)間

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性

本方法建立0.50～40.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按照2.2.1所述液相色譜條件進(jìn)樣分析后，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液(見圖3)。結(jié)果表明，上述標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 93，苯并芘與色譜峰面積呈良好的線形關(guān)系，符合歐盟2002/657/EC法規(guī)中R2＞0.99的要求。

圖3 苯并芘標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 方法回收率

本文選取一個(gè)不含有苯并芘的植物油作為空白基質(zhì)，加入苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液制備加標(biāo)樣本。考慮到植物油的限量標(biāo)準(zhǔn)10 μg/kg，本方法選擇了0.5倍、1倍和2倍的限量標(biāo)準(zhǔn)為加標(biāo)濃度，制備了含量為5、10、20 μg/kg的加標(biāo)樣本，按照上文所述方法進(jìn)行檢測，共重復(fù)平行樣本3次，結(jié)果見表1。驗(yàn)證結(jié)果顯示，該方法加標(biāo)回收率在88% ～92%之間，符合歐盟2002/657/EC法規(guī)在5～20 μg/kg濃度下，回收率應(yīng)在60%～115%之間的要求。

表1 方法回收率

2.2.3 日間精密度

精密度驗(yàn)證采用2.2.2章節(jié)中相同的加標(biāo)樣品，按照上文所述方法進(jìn)行檢測，重復(fù)檢測3 d，每天重復(fù)平行樣本3次，檢測結(jié)果見表2。驗(yàn)證結(jié)果顯示，該方法日間精密度在1.4% ～2.2%之間，符合歐盟2002/657/EC法規(guī)在該濃度下，日間精密度應(yīng)小于16%的要求。

表2 日間精密度

2.2.4 靈敏度

考慮到植物油的限量標(biāo)準(zhǔn)10 μg/kg，本研究以0.1倍限量標(biāo)準(zhǔn)，采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法，配制1 μg/kg的加標(biāo)樣本。該樣本按照本文上述方法進(jìn)行預(yù)處理和檢測，色譜圖如圖4所示。該樣本的信噪比為167.28。以3倍信噪比(3S/N)所對應(yīng)的樣品中標(biāo)準(zhǔn)品濃度為檢出限(limit of detection，LOQ)，計(jì)算得該方法的檢出限為0.018 μg/kg，以10倍信噪比(10S/N)所對應(yīng)的樣品中標(biāo)準(zhǔn)品濃度為定量限(limit of quantification，LOQ)，計(jì)算出該方法的定量限為 0.060 μg/kg。

3 結(jié)論

圖4 樣品圖譜

本文所建立的植物油中的苯并芘檢測方法，與現(xiàn)有的國標(biāo)(GB 5009.27—2016)相比，在樣品凈化、檢測方式上進(jìn)行了改進(jìn)。樣品凈化方面，本方法采用凝膠色譜法。凝膠色譜法可有效的去除樣品中的脂類、色素、蛋白質(zhì)等大分子干擾物質(zhì)，從而減小基質(zhì)效應(yīng)、降低分析背景、改善色譜峰行。且凝膠色譜從上樣、洗脫，濃縮，溶劑轉(zhuǎn)換到最后的定容完全實(shí)現(xiàn)全自動化，一方面可以縮減繁瑣的前處理工作，另一方面可以避免在前處理過程中帶入的人員誤差。在檢測方式上引入了超高效液相，相比于傳統(tǒng)的高效液相靈敏度更好，且檢測時(shí)間大大縮減，提高了工作效率。該方法簡單、快速、高效，為食用油中苯并芘的定性、定量分析提供了一種重要途徑。