黃花蒿離體再生體系優(yōu)化研究

楊正修+張學(xué)文+羅莎+龍炎杏+趙燕

摘要：為優(yōu)化黃花蒿（Artemisia annua Linn）離體再生體系，并建立黃花蒿遺傳轉(zhuǎn)化途徑，選用黃花蒿常規(guī)品種428-A為材料，以子葉、幼嫩葉片、頂芽作為外植體，設(shè)計(jì)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，黃花蒿子葉適宜作為組織培養(yǎng)的外植體，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)愈傷組織形成和分化，其出愈率及出芽率分別高達(dá)89.0%、85.7%，1/2MS+0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IAA培養(yǎng)基有利于再生植株不定根的誘導(dǎo)，生根誘導(dǎo)率達(dá)94.0%。

關(guān)鍵詞：黃花蒿（Artemisia annua Linn）；外植體；子葉；植株再生體

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）06-1161-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.042

Abstract： In order to optimize Artemisia annua Linn in vitro regeneration system and establish transformation way，the conventional varieties 428-A of Artemisia annua Linn as material was chose. Cotyledon，young leaves， crown were used as explant，the simple and effective regeneration system of Artemisia annua Linn was set up，by using different types and different concentrations of plant growth regulator of the formula. The results indicated that the young leaves is the best material for the tissue culture of explant. The best solid medium of callus formation and differentiation is MS+1.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，the rate of callus formation is 89.0% and the rate of budding is 85.7%. The most useful solid medium of inducing of root is 1/2MS+0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IAA， in which the rooting rate reached 94.0%.

Key words： Artemisia annua Linn； explants； young leaves； vitro

黃花蒿（Artemisia annua Linn）為一年生艾屬菊科草本植物，在中國(guó)已經(jīng)有兩千多年的藥用歷史[1]。從黃花蒿中分離出的活性單體成分青蒿素（Artemisinin），被證明是一種高效、低毒、副作用小的新型抗瘧活性成分，已廣泛應(yīng)用于臨床[2]。同時(shí)青蒿素及其衍生物在抗腫瘤、抗心血管疾病、鎮(zhèn)痛、免疫、抗血吸蟲、抗病原蟲等方面也具有顯著療效[3]。

黃花蒿在世界范圍內(nèi)分布廣泛，產(chǎn)地環(huán)境條件差異大，青蒿素含量變化也十分明顯[4]。在中國(guó)，青蒿中青蒿素的含量從南到北基本呈遞減趨勢(shì)，其提取成本高，導(dǎo)致青蒿素價(jià)格居高不下，難以滿足市場(chǎng)需要[5]。近年來(lái)，人們嘗試從組織培養(yǎng)及擴(kuò)繁技術(shù)獲得的黃花蒿中分離青蒿素，單位產(chǎn)量黃花蒿中分離的青蒿素含量高于野生黃花蒿[6]。通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行離體快繁，不僅可為生產(chǎn)上提供大量黃花蒿試管苗，推動(dòng)優(yōu)質(zhì)黃花蒿生產(chǎn)的發(fā)展，而且可使其成為提高青蒿素產(chǎn)量的重要途徑[7]。

近年來(lái)，在黃花蒿的組織培養(yǎng)方面，目前已通過(guò)其葉片、莖尖、莖段、花序等多種外植體誘導(dǎo)愈傷及再生植株，但不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和組合，在不同基因型黃花蒿品種上應(yīng)用差別較大，結(jié)果不盡一致[8]，其組培過(guò)程中的玻璃化現(xiàn)象也較嚴(yán)重[9]。本試驗(yàn)分別以子葉、葉片、頂芽作為外植體，在不同組織培養(yǎng)階段添加不同種類和不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以優(yōu)化培養(yǎng)基配方，建立簡(jiǎn)單有效的再生體系，為黃花蒿的遺傳轉(zhuǎn)化和優(yōu)良種質(zhì)的保存及改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃花蒿種子為常規(guī)品種428-A，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院朱衛(wèi)平副教授惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基

1）基本培養(yǎng)基：MS+3%蔗糖+7%瓊脂，pH 5.8。

2）愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基：以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置NAA、6-BA、KT 3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不同濃度組合，進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)、增殖及不定芽分化培養(yǎng)。

3）不定芽生根培養(yǎng)基：以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置NAA、IAA的不同濃度組合誘導(dǎo)生根。

1.3 外植體的獲得

1）將脫脂棉浸透MS液體培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿一起經(jīng)高壓蒸汽滅菌備用。將黃花蒿種子放入離心管中，加入1 mL 0.1%HgCl2溶液，快速混勻、懸浮，6 000 r/min離心2 min，無(wú)菌條件下吸出升汞，再用無(wú)菌水清洗5～6次，然后將種子均勻鋪到放有脫脂棉的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使其發(fā)芽獲得無(wú)菌苗。在黃花蒿幼苗生長(zhǎng)的不同時(shí)間取發(fā)育良好的子葉、葉片和頂芽分別作為外植體接種到不同濃度配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基上。

2）直接將種子播種在腐殖土∶蛭石（3∶1）的營(yíng)養(yǎng)土上，3～4 d即可萌發(fā)，分別取長(zhǎng)出子葉或葉片的健壯植株放入0.1%的HgCl2溶液中消毒10 min，切下子葉、葉片和頂芽作為外植體。

1.4 外植體的接種

將消毒的外植體接種于不同的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷的形成及分化，記錄并統(tǒng)計(jì)出愈數(shù)、芽分化數(shù)；再將分化生長(zhǎng)的無(wú)根苗接種在不同生根培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為每日光照10～12 h，光照度為1 500～2 000 lx，溫度（25±2） ℃。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的獲得

采用無(wú)菌苗和實(shí)生苗為外植體，分別于子葉期、幼苗期取材接種，兩種來(lái)源的外植體中，無(wú)菌苗所取外植體，在后期培養(yǎng)時(shí)不易染菌，感染率較低，但種子無(wú)菌發(fā)芽時(shí)萌發(fā)較晚，且植株較自然條件下生長(zhǎng)勢(shì)偏弱，在后期誘導(dǎo)分化過(guò)程中生活力偏低。自然條件下發(fā)芽的實(shí)生苗植株較健壯，生長(zhǎng)發(fā)育快，6～7 d子葉展開，7～14 d，幼苗長(zhǎng)出兩片羽狀葉片，20 d后，幼苗部分葉片生長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)即可進(jìn)行葉片外植體接種。由于實(shí)生苗生長(zhǎng)健壯，取材方便，更適合大批量接種，但接種時(shí)應(yīng)盡量減少感染。

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織形成和分化的影響

黃花蒿愈傷組織形成、芽分化、生根及試管苗如圖1所示。

由表1可以看出，4～12號(hào)培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)黃花蒿的子葉、葉片或頂芽等外植體形成愈傷組織，而1～3號(hào)、13～15號(hào)培養(yǎng)基外植體均未誘導(dǎo)出愈傷。通過(guò)對(duì)1～3號(hào)培養(yǎng)基與4～6號(hào)培養(yǎng)基比較可以表明，NAA對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的形成是必要的，1.0～2.0 mg/L 6-BA均能誘導(dǎo)愈傷組織，且當(dāng)6-BA達(dá)到3 mg/L時(shí)易引起組織玻璃化，而1.5 mg/L 6-BA的濃度較為合適。

而在5、7、8、9號(hào)培養(yǎng)基中，1.5 mg/L 6-BA、0.05 mg/L NAA時(shí)，其誘導(dǎo)率和分化效率最佳。其中4、5、6號(hào)培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率較高，且形成的愈傷色澤淺綠、結(jié)構(gòu)致密，生長(zhǎng)速度快，分生能力強(qiáng)，為典型的Ⅰ型愈傷組織。

對(duì)4～12號(hào)培養(yǎng)基研究表明，在黃花蒿的愈傷組織誘導(dǎo)中NAA和KT都是必需的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，NAA比KT更能高效地誘導(dǎo)愈傷組織的形成和分化。通過(guò)對(duì)1-3號(hào)培養(yǎng)基單獨(dú)添加6-BA的培養(yǎng)基和13～15號(hào)培養(yǎng)基同時(shí)添加6-BA、KT、NAA的培養(yǎng)基比較發(fā)現(xiàn)：外植體可以從器官型途徑直接分化出芽，其中1～3號(hào)培養(yǎng)基出芽率偏低，叢芽生長(zhǎng)緩慢，且當(dāng)6-BA達(dá)到3 mg/L時(shí)易引起組織玻璃化。在13～15號(hào)培養(yǎng)基中，雖出芽率較1～3號(hào)培養(yǎng)基高，但總體效率較4～6號(hào)培養(yǎng)基低，雖然4～7號(hào)培養(yǎng)基要經(jīng)過(guò)短暫愈傷才分化出芽，但其出愈時(shí)間快，且剛出愈后便迅速分化出叢芽，分化率高、時(shí)間短，而13～15號(hào)培養(yǎng)基雖直接出芽但其分化時(shí)間長(zhǎng)，叢芽生命力差，生長(zhǎng)緩慢。綜上所述，5號(hào)培養(yǎng)基是誘導(dǎo)愈傷和分化不定芽的合適培養(yǎng)基。

SPSS單因素方差分析表明，本試驗(yàn)的P<0.001，差異極顯著，說(shuō)明由于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不同造成的分生芽數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度能夠極顯著影響不定芽的產(chǎn)生和分化。

2.3 外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別以黃花蒿實(shí)生苗子葉、葉片、頂芽等作為外植體誘導(dǎo)分化，結(jié)果見表2～表4。子葉、葉片、頂芽均能誘導(dǎo)愈傷，其5號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)率均高于其他培養(yǎng)基，其中以子葉為外植體誘導(dǎo)率達(dá)最高到94%，出愈時(shí)間為最短（11 d），以羽狀葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷時(shí)，愈傷啟動(dòng)后葉片容易出現(xiàn)黃化且誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，以頂芽為外植體誘導(dǎo)愈傷，雖然誘導(dǎo)率與子葉的誘導(dǎo)效果相差不大，但誘導(dǎo)時(shí)間比子葉平均長(zhǎng)3.5 d，且接種過(guò)程中易造成感染，愈傷增值后容易褐化，不定芽分化率偏低。3種外植體中，子葉誘導(dǎo)的胚性愈傷組織，誘導(dǎo)時(shí)間短，效率高，后期的分化及出苗率均高于以葉片、頂芽誘導(dǎo)的愈傷。結(jié)果表明，在該基因型的黃花蒿子葉較適合作為外植體。

2.4 幼苗的生根

以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置NAA，IAA的不同濃度組合誘導(dǎo)生根，結(jié)果如表5所示。由表5可知，4種培養(yǎng)基都可誘導(dǎo)黃花蒿不定根的生成，只是生根時(shí)間和數(shù)量有差異。其中4號(hào)培養(yǎng)基，即1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA為生根較佳培養(yǎng)基，生根率高且根粗壯。當(dāng)將幼苗接種于此培養(yǎng)基中時(shí)，第8天便有根出現(xiàn)，再過(guò)4～5 d不定根的數(shù)量增多，根系增長(zhǎng)且粗壯。1號(hào)培養(yǎng)基，即1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA不定根的誘導(dǎo)效率偏低，可能是由于生長(zhǎng)素濃度的降低，影響了根尖分生組織的分裂進(jìn)而影響了生根效果。

SPSS單因素方差分析表明，試驗(yàn)中P<0.001，具有極顯著性差異，說(shuō)明植物生長(zhǎng)物質(zhì)種類和濃度的不同對(duì)幼苗生根的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是影響生根效率的重要因素。

3 討論

3.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響

在培養(yǎng)基中添加外源性植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例十分重要，是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、分化以及正常分化成苗的關(guān)鍵因素，合適的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的選擇有利于建立優(yōu)化的再生體系，為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供基礎(chǔ)。賈秀山等[10]認(rèn)為誘導(dǎo)黃花蒿愈傷組織形成的最佳培養(yǎng)基配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L KT；誘導(dǎo)黃花蒿愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA。而本研究中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)黃花蒿愈傷形成的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比也剛好適用于不定芽的分化，因此愈傷誘導(dǎo)和不定芽分化可以同步進(jìn)行，期間不需頻繁更換培養(yǎng)基，這樣可以大大縮短組培苗的時(shí)間，提高快繁效率，適應(yīng)較大規(guī)模的試管苗繁殖。同時(shí)，黃花蒿愈傷誘導(dǎo)和不定芽分化同步進(jìn)行的發(fā)育模式也為黃花蒿的遺傳轉(zhuǎn)化體系提供了簡(jiǎn)單方便的分化途徑。唐鳳鸞等[11]利用加入6-BA和IBA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)黃花蒿生芽，張麗珍等[12]利用6-BA+IBA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)葉片出愈及分化。而本研究則利用6-BA與NAA的組合培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷及分化出芽，且分化效率較高，其結(jié)果豐富并優(yōu)化了黃花蒿快繁體系的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類。于飛飛等[13]認(rèn)為外植體在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽效果最好，這與本試驗(yàn)結(jié)果有差異，分析原因可能與不同基因型的黃花蒿品種內(nèi)源激素差異有關(guān)。王夢(mèng)瓊等[6]利用6-BA與KT的組合對(duì)黃花蒿葉片、花序進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)果不佳，本研究用其組合誘導(dǎo)子葉出芽，其誘導(dǎo)效果同樣不理想。說(shuō)明KT在黃花蒿外植體出芽誘導(dǎo)中作用可能不大。

3.2 外植體的影響

黃花蒿組織培養(yǎng)的研究主要集中在誘導(dǎo)分化的方式與外植體的選擇上。不同外植體的分化難易程度各不相同，這與外植體的生長(zhǎng)情況、生理生化特性等緊密相關(guān)。趙欣等[14]利用MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基組合以青蒿的根、莖、葉片作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，其誘導(dǎo)效率以根為最佳，莖和葉片次之。楊耀文等[15]利用黃花蒿幼嫩的花序，莖段誘導(dǎo)愈傷組織的形成分化，發(fā)現(xiàn)花序的增殖率是莖段的2～3倍。賈秀山等[10]分別對(duì)葉片、帶腋芽的花序、和莖段進(jìn)行誘導(dǎo)分化，其中葉片誘導(dǎo)愈傷出愈率較低，但后期愈傷組織的分化率、出苗率都很高，帶腋芽的莖段誘導(dǎo)愈傷組織形成最快，但分化率較低，易褐變，花序基本不形成肉眼可見的愈傷組織，而是直接形成幼苗。王夢(mèng)瓊等[16]以黃花蒿花序?yàn)橥庵搀w分別進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及芽和根的分化，結(jié)果黃花蒿愈傷組織誘導(dǎo)率為100%，芽分化率為100%，根的分化率可達(dá)85%。本研究中以葉片為外植體的誘導(dǎo)結(jié)果與上述研究結(jié)果有相似之處，采用頂芽為外植體其誘導(dǎo)、分化效率與伍曉麗等[17]，張偉華[18]報(bào)道的一致。但以子葉作為外植體誘導(dǎo)愈傷和叢芽時(shí)，發(fā)現(xiàn)子葉的誘導(dǎo)效率更優(yōu)于葉片和頂芽，且取材方便、實(shí)用，該結(jié)果可為黃花蒿快繁體系的優(yōu)化，建立黃花蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系提供有效途徑。

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