超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定草莓中醚菌酯殘留量

李國烈，覃明麗，蘇 旭，杜 鑫，蔣金芳，何沛蓉，何家國

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，四川 南充 637000)

醚菌酯化學(xué)名稱為(E)-2-甲氧亞氨基-[2-(鄰甲基苯氧基甲基)苯基]乙酸甲酯，屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，具有高效、廣譜、低毒等特點，其作用機理在于阻斷真菌產(chǎn)生ATP，使真菌停止生長或受到抑制。醚菌酯主要用于防治卵菌綱、藻菌綱、子囊菌綱、半知菌綱的真菌病害，現(xiàn)已被廣泛用于防治草莓白粉病和黃瓜白粉病等病害[2-6]。目前國內(nèi)外醚菌酯殘留分析方法主要包括液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等、氣相色譜法[9-12]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]。醚菌酯在草莓中的殘留檢測方面，李輝等[15]報道了采用氣相色譜法測定醚菌酯在草莓中的殘留，他們使用丙酮提取，二氯甲烷萃取，弗羅里硅土層析柱凈化，氣相色譜儀石英毛細(xì)管柱分析，外標(biāo)法定量。最終得出在0.006和1.000mg/kg添加水平下(5個平行)，平均回收率分別為88.19%和92.02%，回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.76%和7.47%。趙爾成等[16]報道了采用氣相色譜-質(zhì)譜儀測定草莓中醚菌酯的殘留，他們采用乙腈提取，PSA和無水硫酸鎂凈化，氣相色譜-質(zhì)譜儀DB-5 MS色譜柱分析。最終指出該方法的檢出限為0.05mg/kg，并且在0.05和0.5mg/kg添加水平下(5個平行)，醚菌酯的回收率在85.3%～104.5%，平均為97%和92%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.8%和7.3%。到目前為止，尚未見報道采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定醚菌酯在草莓中的殘留。本試驗建立了草莓中醚菌酯殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(UPLC-MS/MS)，以期為進(jìn)行風(fēng)險評估和監(jiān)測食品安全提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品和試劑 醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所(編號：SB-212-2008)，甲醇、乙腈，甲苯，甲酸均為色譜級，購自Fisher公司。

1.2 儀器和設(shè)備 超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(Waters，UPLC-TQS)，色譜柱(Waters，Xbridge C18，3.5μm 3.0×50mm)，超純水儀(Millipore，Milli-Q)，旋渦混合器(IKA，Vortex Genius 3)，勻漿機(IKA，T25)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮，RE-2000A)，固相萃取小柱(Agilent，CARB/NH2500mg/6mL)，固相萃取裝置(Agilent)以及微孔濾膜(津騰，PTFE 0.22μm)等。

1.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取勻漿后的草莓樣品25.00g于250mL三角瓶中，加入50.00mL乙腈，用勻漿機高速勻漿2min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有10g氯化鈉的100mL具塞量筒中，蓋上塞子，劇烈震蕩1min，在室溫下靜置30min，移取出上清液10.00mL待凈化。

1.4 樣品凈化 將移取的10.00mL提取液加入已經(jīng)過5 mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)預(yù)淋洗ProElut CARB/NH2柱(500mg/6mL)，收集淋洗液，再用25mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)分5次洗脫，合并淋洗液，于40℃水浴鍋蒸發(fā)近干，用5.00mL 70%甲醇定容，過0.22μm濾膜，待檢測。

1.5 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件 流動相采用甲醇，乙腈和含有0.1%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序(表1)，流動相使用前用超聲波脫氣。柱溫：40℃，進(jìn)樣量：3.0μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式進(jìn)行采集，相關(guān)參數(shù)(表2)。

表1 流動相及梯度洗脫條件

表2 測定醚菌酯在草莓中殘留的質(zhì)譜參數(shù)

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限 分別取一定量的醚菌酯標(biāo)品溶液用草莓空白基質(zhì)配制成濃度為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00和50.00μg/L的標(biāo)準(zhǔn)液，采用1.5儀器條件進(jìn)行分析，以醚菌酯定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸分析求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用Masslynx V4.1軟件繪制。檢測限采用在最低濃度附近添加一系列已知濃度的雙份樣品進(jìn)行測定，采用Masslynx V4.1軟件計算醚菌酯的信噪比(S/N)，以S/N≥3時的樣品濃度為方法檢測限[17]。

1.7 加標(biāo)回收和精密度 取草莓空白樣品，根據(jù)高、中、低3個濃度分別加入相應(yīng)的醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平做6個平行質(zhì)控樣品。所有樣品按1.3和1.4進(jìn)行樣品前處理，采用1.5儀器條件測定藥物濃度，計算方法的加標(biāo)回收。精密度試驗采用加入法。取草莓空白樣品，根據(jù)高、中、低3個濃度分別加入相應(yīng)的醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平做6個平行。所有樣品按1.3和1.4進(jìn)行樣品前處理，采用1.5儀器條件測定藥物濃度，連續(xù)測定3d，根據(jù)隨行測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的實測濃度，即可求得方法的日內(nèi)和日間精密度。

1.8 基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和方法過程效率 采用Matuszew ski等[18]提出的方法，比較不同條件下的峰面積平均值。在純的醚菌酯標(biāo)品溶液(A)，草莓樣品基質(zhì)提取后添加醚菌酯標(biāo)品(B)和草莓樣品基質(zhì)提取前添加醚菌酯標(biāo)品(C)3個條件下，分別采用高、中、低3個濃度來評價醚菌酯在草莓樣品中的基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和過程效率，每個條件下重復(fù)測定6個樣品?；|(zhì)效應(yīng)=B/A，提取回收率=C/B，方法過程效率=C/A。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法選擇性 該試驗條件下，醚菌酯采用反相液相色譜分離，流動相中加入0.1%體積分?jǐn)?shù)的甲酸來提高ESI+的離子化效率。結(jié)果表明，醚菌酯保留時間適中(5.25min)，峰形及分離度良好，且可獲得較強的分子離子峰強度，草莓基質(zhì)對草莓樣品中醚菌酯的測定無干擾。醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜、草莓空白樣品圖譜、醚菌酯草莓基質(zhì)匹配標(biāo)液和草莓樣品加標(biāo)圖譜(圖1、圖2、圖3和圖4)。

圖1 醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜(0.50μg/L)圖2 草莓空白樣品圖譜圖3 醚菌酯草莓基質(zhì)標(biāo)液圖譜(0.50μg/L)圖4 草莓加標(biāo)樣品圖譜(0.50μg/L)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限 醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線在質(zhì)量濃度0.50～50.00μg/L時線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=4.284 17×106x+228.13(R2=0.998)。以3倍基線噪音的藥物濃度為最低檢測限，醚菌酯在草莓中的方法檢出限(method detection limit，MDL)為0.10μg/kg。以4倍MDL為測定下限，即4倍方法檢出限濃度作為測定下限，則醚菌酯在草莓中的測定下限為0.50μg/kg[17]。

2.3 加標(biāo)回收和精密度 醚菌酯在0.50、5.00和50.00μg/kg 3個濃度的草莓添加樣品回收率

分別為95.4%、94.3%和92.2%，日內(nèi)精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.75%、3.36%和2.57%，日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.34%、4.24%和5.04%，(表3和表4)。表明該試驗方法在測定草莓中醚菌酯的殘留時具有較好的準(zhǔn)確度。

表3 草莓中醚菌酯加標(biāo)回收(n=6)

表4 草莓中醚菌酯日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和方法過程效率 該試驗條件下，采用提取后加入法從3個濃度水平來評價醚菌酯在草莓樣品中的基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和過程效率，其結(jié)果(表5)。在0.50、5.00和50.00μg/L 3個濃度水平下，醚菌酯在草莓樣品中的基質(zhì)效應(yīng)分別為(96.08±5.01)%、(93.21±1.67)%和(93.31±0.74)%，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，并且基質(zhì)效應(yīng)影響較?。惶崛』厥章史謩e為(95.41±3.51)%、(94.37±4.14)%和(92.19±2.11)%，相應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.69%，4.39%和2.29%，均滿足農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則的要求[19]；方法過程效率分別為(91.64±5.19)%、(87.92±2.96)%和(86.02±1.86)%，表明該試驗方法方法過程效率較好。

表5 3個不同濃度下的信號峰面積及基質(zhì)效應(yīng)、回收率和過程效率的計算結(jié)果(n=6)

3 討論

該試驗樣品采用乙腈提取，石墨化碳黑氨基復(fù)合柱凈化，超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測醚菌酯在草莓中的殘留，該方法前處理過程操作簡便，方法的選擇性好。檢測限和定量限均低于GB 2763-2016中規(guī)定醚菌酯在草莓中的最大限量值(2 mg/kg)[20]，回收率、精密度和提取回收率均滿足農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則的要求。另外，通過基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果可以得出該試驗方法基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果沒有顯著的影響，因此，該試驗方法也可以不采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以簡化試驗過程。