固相萃取-高效液相色譜法在食品中合成著色劑檢測中的應(yīng)用

□ 趙 俊 劉 虹 楚雄彝族自治州食品藥品檢驗所

很多生產(chǎn)廠家為了滿足人們在感官上對食品的需求，而在食品中添加大量的食品合成著色劑，嚴重違反了國家對合成著色劑使用種類還有使用量的規(guī)定，實施非法添加合成著色劑，影響人們的生命安全。就拿配制酒制作來說，為了謀取暴力經(jīng)濟效益，我國在制作配制酒的時候大量摻雜合成著色劑，生產(chǎn)了大量假酒。針對合成著色劑濫用的惡劣現(xiàn)象，需要采取科學合理的方法，對合成著色劑進行檢驗，使產(chǎn)品符合安全要求。

1 檢測設(shè)備和試劑

①實驗設(shè)備：高效液相色譜儀（Thermo Scientific Ultimate 3000）；由上海安譜公司提供的500 mg/3 mL 的聚酰胺 SPE 固相萃取小柱；?？迫詣庸滔噍腿x；渦旋儀以及氮吹儀。②樣品：干紅配制酒。③試劑：檸檬黃、日落黃、胭脂紅、誘惑紅、莧菜紅、亮藍標準品，廠家均 為 Stanford Analytical Chemicals公司，甲醇色譜純、甲酸分析純、氨水分析純、乙酸銨色譜純。④制作標準儲備液：準確稱取檸檬黃、日落黃、胭脂紅、誘惑紅、莧菜紅、亮藍各0.1 h 于100 mL容量瓶中，加水到刻度。配制得濃度為 1 000 mg/L 的標準儲備液；配制混合標準工作液：分別取已經(jīng)制作成功的各種合成著色劑標準儲備液 1 mL 于 100 mL 的容量瓶中，以水定容，最終配制成為濃度10 mg/L的混合標準工作液。

2 合成著色劑實驗檢測方法

2.1 樣品進行預處理和凈化

配制酒的成分復雜，基質(zhì)干擾大，含有一些食品添加劑如防腐劑、合成著色劑、食用香精、酸度調(diào)節(jié)劑，以及天然色素、糖類、有機酸類等成分，不經(jīng)凈化直接進樣對待測成分的測定干擾大，并且還會污染色譜柱，降低柱子的使用壽命。按照國標GB/T 5009.35-2016中的處理方法，采用聚酰胺粉吸附，用G3垂融漏斗抽濾的凈化方法，操作不方便，重現(xiàn)性和回收率都不是很理想，而且不適合大批量樣品同時處理，不易做自動化方法移植。

針對本試驗中選取樣品配制酒，選用聚酰胺柱SPE固相萃取小柱，用以吸附食品中的合成著色劑，選用氨化甲醇洗脫，濃縮時間短，適用于實驗室大批量樣品的同時處理。配制酒樣品直接進行固相萃取，然后先用5 mL的甲醇活化聚酰胺小柱，再用5 mL的水進行再次活化。選取5 mL樣品上清液上柱，用3 mL配制體積比例為2∶2∶6的甲醇-甲酸-水溶液淋洗萃取柱，流速控制在1.5～2 mL/min，等到所有流出液被去除后進行真空抽干，再用7 mL濃度10%的氨水-甲醇溶液進行洗脫，最后收取洗脫液，用40 ℃的氨氣吹干，再與1 mL的水混合均勻，經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾，最后將過濾后的凈化處理樣品進行液相分析。

2.2 進行高效液相色譜檢測合成著色劑需要具備的色譜條件

選用的色譜柱，規(guī)格250 mm×4.6 mm， 序 號 SN 498533 ，Agilent 5 TC-C18（2）C18柱；流動相，甲醇和濃度為0.02 mmol/L的乙酸銨溶液；進樣量，20 μL。梯度洗脫程序：①體積比為10∶90的甲醇和乙酸銨溶液洗脫不超過1 min；②體積比為20∶80的甲醇和乙酸銨溶液洗脫3 min；③體積比為70∶30的甲醇和乙酸銨溶液洗脫7 min；④體積比為10∶90的甲醇和乙酸銨溶液洗脫7 min；⑤體積比為10∶90的甲醇和乙酸銨溶液洗脫11 min；流速控制在 1 mL/min，柱溫度控制在25 ℃，檢測器使用二極管陣列檢測器，3D掃描。進行色譜分析，處理波長時：檸檬黃428 nm、日落黃485 nm、胭脂紅510 nm、誘惑紅510 nm、莧菜紅520 nm、亮藍 630 nm。

3 色譜檢測結(jié)果及分析

3.1 最優(yōu)色譜檢測條件

（1）按照通常的研究來說，實驗中的6種合成著色劑在254 nm的波長條件下能夠最大吸收，但在實際操作中，此波長度會存在多種物質(zhì)吸收，導致許多干擾峰出現(xiàn)，抬高色譜基線（圖1），并不是合適的色譜檢測波長。而在各種合成著色劑可見光區(qū)最大吸收波長下檢測，雖然會在一定程度上弱化對標準信號的收集，但是能夠有效避免雜質(zhì)，增加檢測靈敏度（圖2）。

（2）根據(jù)流動相比例調(diào)整確定梯度洗脫標準條件。針對不同的合成著色劑分別在不同時刻不同波長條件下掃描3D光譜結(jié)果，繪制標準品液色譜圖，如圖3所示。在這樣的條件下，各著色劑能夠很好地分離。

3.2 樣品凈化

通過研究可以發(fā)現(xiàn)，就算在各種合成著色劑可見光區(qū)最大吸收波長下收集色譜信號也會產(chǎn)生基質(zhì)干擾，如圖4所示，需要實施進一步凈化。針對本試驗中選取的基質(zhì)干擾比較中的食品樣品——配制酒，需要用聚酰胺柱進行凈化。配制酒樣品直接進行固相萃取，然后先用3 mL的甲醇活化聚酰胺小柱，再用3 mL的水進行再次活化。選取5 mL樣品上清液上柱，用3 mL配制體積比例為2∶2∶6的甲醇-甲酸-水溶液淋洗萃取柱，流速控制在1.5～2 mL/min，清除大部分的干擾雜質(zhì)，然后再用氨水-甲醇溶液進行解吸，最后將收集到的洗脫液進行氮吹定容。經(jīng)過固相萃取凈化的液相色譜圖，如圖5所示。

圖1 254 nm波長條件下，樣品的液相色譜圖（AU）

圖2 樣品在可見光區(qū)最大吸收波長下檢測得到的液相色譜圖（AU）

圖3 標準樣品液相色譜圖（AU）

圖5 固相萃取凈化后的液相色譜圖（AU）

圖4 白葡萄酒樣品可見光區(qū)最大吸收波長條件下的液相色譜圖（AU）

可以對比圖4、5，樣品經(jīng)過固相萃取后，凈化程度得到一定提高，得到的液相色譜圖已經(jīng)少了很多雜質(zhì)干擾。但是，還是存在一定的基質(zhì)干擾，還需要采取更加先進的處理方法進一步凈化，液相色譜檢測需要進一步優(yōu)化。

3.3 利用固相萃取-液相色譜法檢測合成著色劑的回收率

將合成著色劑的混合標準溶液稀釋成為不同濃度的標準溶液，然后在3個標準量水平，幾點檢測低限、2倍檢出限、10倍檢出限下進行6次進行合成著色劑回收率檢測實驗，具體結(jié)果見表1。

由表1可知，反復進行液相色譜檢驗著色劑回收率檢驗，表現(xiàn)性好。

4 實驗結(jié)論

采用固相萃取-高效液相色譜法檢測合成著色劑，經(jīng)過科學的樣品提取、凈化，檢測時要注意使用聚酰胺柱凈化，在各種合成著色劑光區(qū)最大吸收波長下進行信號收集，最大程度避免雜質(zhì)干擾，提高著色劑的檢驗靈敏度。本實驗檢驗方法有利于快速高效地檢驗人工合成著色劑，值得推廣。

表1 固相萃取-液相色譜法檢測合成著色劑的回收率結(jié)果