裸花紫珠提取物對(duì)銀屑病作用及機(jī)制研究

巴立娜

[摘要] 目的 探討裸花紫珠提取物抗銀屑病作用。 方法 60只KM小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、裸花紫珠提取物低劑量組、裸花紫珠提取物中劑量組、裸花紫珠提取物高劑量組和陽(yáng)性藥對(duì)照組，每組各12只。分別灌胃給予生理鹽水，0.6、1.2、2.4 g/kg裸花紫珠提取物，1 mg/kg甲氨蝶呤，連續(xù)7 d。HE法檢測(cè)完整顆粒層鱗片數(shù)；Western blot技術(shù)檢測(cè)Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、BCL-2蛋白表達(dá)；Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)Caspase3、Bax、BCL-2基因mRNA表達(dá)。 結(jié)果 裸花紫珠中、高劑量組鼠尾完整顆粒層鱗片數(shù)明顯高于模型組（P < 0.05）；裸花紫珠中、高劑量組促凋亡蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax蛋白和mRNA表達(dá)均高于模型組（P < 0.05），抗凋亡蛋白BCL-2蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)（P < 0.05）。 結(jié)論 裸花紫珠提取物通過(guò)誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗銀屑病作用。

[關(guān)鍵詞] 裸花紫珠；銀屑?。活w粒層；凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）07（c）-0014-05

Study of effect and potential mechanism of Callicarpa nudiflora extract against psoriasis

BA Li′na

Basic Medical College， Harbin Medical University （Daqing）， Heilongjiang Province， Daqing 163319， China

[Abstract] Objective To determine the anti-psoriasis effect of Callicarpa nudiflora extract. Methods Sixty KM mouses were randomly divided into 5 groups by random number table （n = 12）， including model group， Callicarpa nudiflora low-dose group， Callicarpa nudiflora middle-dose group， Callicarpa nudiflora high-dose group and positive control group. They were given to normal saline， Callicarpa nudiflora extract （0.6 g/kg or 1.2 g/kg or 2.4 g/kg） and 1 mg/kg methotrexate by gastric perfusion for seven days respectively. Lateral line scales of granular layer were detected by HE method. The expression of Caspase3， Cleaved-Caspase3， Bax and BCL-2 mRNA and protein were detected by Real-time PCR and Western blot. Results Lateral line scales of granular layer of Callicarpa nudiflora middle-dose and high-dose groups was increased than those in the model group （P < 0.05）. The expression of the pro-apoptotic proteins Caspase3， Cleaved-Caspase3， Bax mRNA and protein in callicarpa nudiflora middle-dose and high-dose groups were up-regulated than those in the model group （P < 0.05）， the expression of the anti-apoptotic protein BCL-2 mRNA and protein was down-regulated （P < 0.05）. Conclusion The Callicarpa nudiflora extract can exert anti-psoriatic effect by inducing apoptosis.

[Key words] Callicarpa nudiflora； Psoriasis； Granular layer； Apoptotic

銀屑病俗稱(chēng)為牛皮癬，是一種紅斑鱗屑炎癥自身免疫皮膚病[1]，其發(fā)病率高、發(fā)病原因多樣、病程較長(zhǎng)、對(duì)病人的身心具有嚴(yán)重影響，但是發(fā)病機(jī)制尚不明確[2-5]。發(fā)病特征主要包括表皮細(xì)胞的過(guò)度增殖、分化異常、以及凋亡減少[6]。細(xì)胞凋亡也稱(chēng)為細(xì)胞程序性死亡，是一種基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)性的“自殺”過(guò)程。這個(gè)過(guò)程被促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白共同調(diào)控[7]。Caspase3可以加速與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期等相關(guān)的蛋白或激酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。Caspase3活化標(biāo)志凋亡進(jìn)入不可逆階段[9]。BCL-2蛋白家族是調(diào)控Caspase蛋白激活的一類(lèi)重要的細(xì)胞因子。BCL-2主要分為抗凋亡和促凋亡兩個(gè)亞族，其中抗凋亡亞族主要有BCL-2等，促凋亡亞族主要包括Bax等[10]。中藥裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook）傳統(tǒng)的藥理作用包括抗炎、解毒、收斂、止血等[11-12]。在臨床上，裸花紫珠也被用于皮膚病的治療，但其抗銀屑病的作用并未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探討裸花紫珠提取物對(duì)小鼠鼠尾銀屑病模型的作用及其機(jī)制是否與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)KM小鼠，體重18～22 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。將60只小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后（飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對(duì)濕度50%～65%）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑

甲氨蝶呤片（MTX，上海信誼藥廠(chǎng)有限公司），Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、BCL-2抗體（Cell Signaling公司，美國(guó)），Caspase3、BCL-2、Bax mRNA引物（Pall Life Science公司，美國(guó)），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，USA），SYBR Green PCR Master Mix（Invitrogen，USA）。

1.2.2裸花紫珠提取物

裸花紫珠藥材（產(chǎn)地為海南，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院華南植物園華南植物鑒定中心葉華谷研究員鑒定為裸花紫珠Callicarpa nudiflora，標(biāo)本現(xiàn)存于中國(guó)科學(xué)院華南植物園標(biāo)本館）。裸花紫珠提取物制備方法：裸花紫珠干燥葉4 kg經(jīng)80%乙醇加熱回流提取3次，提取液經(jīng)過(guò)濾，合并濾液，減壓蒸餾至膏狀，冷凍干燥，得到干粉。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1銀屑病動(dòng)物模型

1.3.1.1小鼠鼠尾銀屑病模型 正常小鼠尾部，鱗狀上皮缺乏顆粒層，角質(zhì)層內(nèi)有殘留細(xì)胞核，為自然角化異常，類(lèi)似于銀屑病角化不全的病理生理改變，故無(wú)需造模即可用其檢測(cè)藥物對(duì)銀屑病作用[13]。

1.3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥處理

將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即模型組，裸花紫珠提取物低（0.6 g/kg）、中（1.2 g/kg）、高（2.4 g/kg）劑量組，陽(yáng)性藥對(duì)照組，每組12只，灌胃給藥連續(xù)7 d。

1.3.3 HE染色

將鼠尾組織取材后放入10%甲醛中固定，石蠟切片，將過(guò)夜的載有蠟片的玻片分別放入蘇木精、鹽酸酒精分化液、伊紅液；再依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇（2次）、乙醇與二甲苯為1∶1溶液（2次），用中性樹(shù)膠封片。晾干后顯微鏡下觀察[13]。

1.3.4 Western blot

將組織蛋白樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、標(biāo)記抗體Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、BCL-2（1∶1000）后，用紅外熒光掃描系統(tǒng)檢測(cè)，以GAPDH作內(nèi)參，拍照，并用圖像分析軟件odyssey1.2進(jìn)行光密度積分值分析[14]。

1.3.5 Real-time PCR

將組織總RNA提取后逆轉(zhuǎn)錄，以β-actin作為內(nèi)參，采用Applied Biosystems的SYBR？誖Green PCR Master Mix試劑盒步驟進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。取cDNA（1 μL），依次加入SYBR Green PCR Master Mix（2×）10 μL、ROX High（50×）0.4 μL、引物0.3 μL，用PCR-grade water補(bǔ)齊至20 μL，反應(yīng)條件為：95℃ 10 min預(yù)變性，95℃ 15 s變性，60℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，35個(gè)循環(huán)。最后使用ABI 7900熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采用2-△△Ct方法[15]。各基因的引物序列見(jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸花紫珠提取物對(duì)鼠尾顆粒層形成的影響

鏡下觀察HE染色鼠尾切片的顆粒層狀態(tài)，計(jì)數(shù)每一百個(gè)鱗片上皮中有完整顆粒層的鱗片個(gè)數(shù)，共計(jì)數(shù)300，取平均值。與模型組比較，中、高劑量組裸花紫珠提取物和陽(yáng)性藥對(duì)照組完整顆粒層的鱗片數(shù)目增多（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 裸花紫珠提取物對(duì)鼠尾組織凋亡蛋白表達(dá)的影響

取裸花紫珠提取物中、高劑量組鼠尾組織提取蛋白，應(yīng)用Western blot檢測(cè)Caspase3、C-Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)改變。結(jié)果表明，與模型組比較，裸花紫珠提取物中、高劑量組促凋亡蛋白Caspase3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）、C-Caspase3、Bax表達(dá)均上調(diào)（P < 0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)（P < 0.05）。見(jiàn)圖2～3。

2.3 裸花紫珠提取物對(duì)鼠尾組織凋亡基因表達(dá)的影響

應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鼠尾組織凋亡基因mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明，與模型組比較，裸花紫珠提取物中、高劑量組Caspase3、Bax基因mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)（P < 0.05），BCL-2 mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)（P < 0.05）。見(jiàn)圖4。

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，也是一種摧殘患者身心的嚴(yán)重疾病[16]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，本研究選擇小鼠鼠尾銀屑病模型[17]，由于小鼠鼠尾顆粒層的缺失，其與銀屑病的生理和病理狀態(tài)十分相似，是天然的銀屑病模型。如果藥物促使顆粒層完整，可以說(shuō)明此種藥物具有抗銀屑病作用[18]。因此選擇此種穩(wěn)定的銀屑病模型，評(píng)價(jià)裸花紫珠提取物的藥效作用。HE染色結(jié)果顯示裸花紫珠提取物組鼠尾顆粒層的完整度高于模型組，提示裸花紫珠提取物具有抗銀屑病作用，并且可能與促進(jìn)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

裸花紫珠的藥理作用包括消炎、解毒、收斂、止血，也被用于各種皮膚病的治療，裸花紫珠可以有效緩解炎癥皮損、疼痛，在局部抑制色素沉積，防止瘢痕形成[19]。在治療痤瘡時(shí)，裸花紫珠可以有效抑制細(xì)菌增殖，同時(shí)使毛囊閉塞的情況得到緩解，進(jìn)而達(dá)到治療目的[20]。但是，裸花紫珠對(duì)于銀屑病的作用及相關(guān)的作用機(jī)制并沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。凋亡的發(fā)生過(guò)程中，一般伴隨多種蛋白表達(dá)的上調(diào)或者下調(diào)[21]，Caspase家族和BCL-2家族是細(xì)胞與凋亡相關(guān)重要的蛋白家族，促凋亡蛋白Caspase3和Bax上調(diào)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而抗凋亡蛋白BCL-2上調(diào)會(huì)抑制細(xì)胞凋亡。通過(guò)Western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax在裸花紫珠提取物組的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)均明顯增高；而B(niǎo)CL-2表達(dá)均顯著下降。同時(shí)，Real-time PCR結(jié)果顯示裸花紫珠提取物組促凋亡基因Caspase3、Bax的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，而抗凋亡基因BCL-2mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，提示裸花紫珠提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)影響凋亡蛋白及其基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

本研究希望更多研究者注意到裸花紫珠治療銀屑病的藥用價(jià)值，對(duì)其相關(guān)作用機(jī)制深入探討，進(jìn)而使裸花紫珠應(yīng)用得到積極推廣，讓更多患者受益。

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（收稿日期：2018-04-17 本文編輯：李岳澤）