內(nèi)毒素經(jīng)不同給藥途徑建立新生鼠急性肺損傷模型對比分析*

羅 艷，李清香，曹云濤（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，貴州遵義563003）

新生兒急性肺損傷（ALI）是新生兒的常見疾病之一，主要由肺內(nèi)外因素引起肺泡炎癥水腫和毛細(xì)血管膜損傷，從而導(dǎo)致肺泡通氣血流比例失調(diào)，其主要臨床表現(xiàn)是缺氧、進(jìn)行性呼吸困難和呼吸衰竭[1-2]。ALI的進(jìn)一步加重可發(fā)展為新生兒急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。隨著人們生活水平的不斷提高，越來越多的早產(chǎn)兒被送入重癥監(jiān)護(hù)室救治。因此，ALI∕ARDS的發(fā)病率和死亡率都不斷提高，成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)之一。

新生兒特別是早產(chǎn)兒，因其免疫力低下，極易被細(xì)菌感染，各類細(xì)菌均可接觸氣道導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)失調(diào)[3-4]。據(jù)統(tǒng)計，氣道感染中以革蘭陰性桿菌感染為主[5]。有學(xué)者報道，革蘭陰性細(xì)菌死亡或活躍繁殖時所釋放的內(nèi)毒素（LPS）（其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖）可通過募集大量中性粒細(xì)胞到氣道局部而引起ALI∕ARDS[6]。然而ALI∕ARDS在人活體肺中的發(fā)生、發(fā)展過程大部分來自于尸體解剖，在一定程度上限制了人們對ALI∕ARDS肺部病理變化的認(rèn)識[7]。因此，動物模型對ALI∕ARDS發(fā)病機(jī)制、有效治療藥物研究具有重要意義。

目前，已報道的LPS誘導(dǎo)ALI∕ARDS動物模型主要針對成人ALI∕ARDS，LPS的給藥途徑主要有氣管給藥、腹腔給藥、尾靜脈給藥。而ALI∕ARDS新生鼠ALI∕ARDS動物模型LPS的給藥途徑主要是腹腔給藥。鑒于臨床引起新生兒肺部感染性損傷的細(xì)菌傳播方式可能為空氣或血源性傳播，是制備最理性的ALI∕ARDS動物模型。本文通過比較LPS鼻腔滴藥、氣管給藥、腹腔給藥3種不同給藥途徑所制備動物模型的區(qū)別，為更好地研究ALI∕ARDS發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠，成年雌性6只，雄性3只，均購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于獨(dú)立、清潔的通氣飼養(yǎng)盒內(nèi)，飼料、水均經(jīng)嚴(yán)格消毒，所有操作于超凈臺內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)過程中，動物的使用嚴(yán)格遵循遵義醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會要求。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 將新生2～3 d SD大鼠分為3組：（1）鼻腔滴藥組（對照組和LPS組），LPS組采用左手大拇指和食指固定新生鼠頭，鼻腔中滴入不同劑量LPS（3、4、5、6、8 mg∕kg），然后分別于 1、6、12、24、72 h 處死新生鼠（n≥5）；對照組鼻腔滴入等量生理鹽水，同樣于1、6、12、24、72 h 處死新生鼠（n≥5）。（2）氣管給藥組（對照組和LPS組）：將新生鼠取仰臥位固定于操作臺上，正中切開頸前皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露氣管。用小兒靜脈留置針植入暴露的氣管后，拔出針芯，LPS組給予氣管內(nèi)滴入LPS（LPS量、處死時間同鼻腔滴藥組）（n≥5）；其對照組給予氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水。（3）腹腔給藥組（對照組和LPS組）：LPS組給予腹腔注入LPS（LPS量、處死時間同鼻腔滴藥組）（n≥5）；其對照組給予氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水。觀察不同組新生鼠給予LPS后的食欲、活動情況及死亡率。依據(jù)第一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將 LPS 劑量選定為 3、4、5 mg∕kg。

1.2.2 組織學(xué)檢查 各組于各時間點(diǎn)用10%水合氯醛麻醉新生SD大鼠，打開胸前后，首先肉眼觀察肺組織的大體病理改變，然后取右肺常規(guī)固定、包埋、脫水、切片后蘇木精-伊紅（HE）染色。肺部病理評分主要依據(jù)參考文獻(xiàn)[8]對肺組織細(xì)支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥、肺泡周圍炎癥進(jìn)行病理評分。

1.2.3 肺組織濕重∕干重（W∕D）比值的測定 處死新生鼠后快速打開胸腔游離雙肺（n=8），首先用無菌紗布蘸干雙肺表面的血水，取左肺稱其濕重（W），然后將其放入57℃烤箱內(nèi)將濕肺烘干（烘烤時間為24 h），再稱其干重（D）；最后計算左肺的W∕D值。以此來反映肺水腫程度。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗 大鼠取仰臥位麻醉，處死新生鼠（n=8），并暴露氣管后用小兒靜脈留置針進(jìn)行氣管插管，用冷磷酸鹽緩沖溶液（PBS）反復(fù)灌洗3次，每次0.3 mL，最終收集PBS共0.5 mL，灌洗液細(xì)胞計數(shù)后離心，取上清液-80℃保存，對細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測，細(xì)胞沉渣瑞氏染色進(jìn)行分類計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graphpad Prism5.03統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)；多樣本間比較采用One-Way ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同時間點(diǎn)、不同劑量、不同途徑給藥后新生鼠的死亡率 給予新生兒鼠LPS后，出現(xiàn)吃奶反應(yīng)差及活動量明顯減少，劑量越大癥狀越明顯，死亡率越高。當(dāng)LPS劑量小于5 mg∕dL時新生鼠死亡率可降低至25%以下。見表1。

2.2 不同時間點(diǎn)不同給藥途徑肺組織的病理改變 當(dāng)LPS劑量為3 mg∕dL時，鼻腔滴藥組、氣管給藥組、腹腔給藥組各個時間點(diǎn)的炎癥病理評分在支氣管細(xì)支氣管周圍、血管周圍、肺間質(zhì)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng) LPS 劑量為 4 mg∕dL 或 5 mg∕dL，滴入LPS后1、24、72 h，支氣管細(xì)支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥、肺間質(zhì)炎癥病理評分與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但時間點(diǎn)為 6、12 h各組病理評分均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1～6。

表1 不同時間點(diǎn)、不同劑量、不同途徑給藥后新生鼠的死亡率比較（n=8）

2.3 不同時間點(diǎn)不同給藥途徑肺組織水腫參數(shù)檢測 LPS經(jīng)鼻腔途徑或腹腔注射途徑進(jìn)入新生鼠肺部6～12 h后，發(fā)現(xiàn)劑量為 3 mg∕kg 或 4 mg∕kg時，肺部水腫明顯且肺臟無明顯出血點(diǎn)，當(dāng)劑量增加至5 mg∕kg時，肺部除水腫外，還可見大量出血點(diǎn)及胸腔積液。當(dāng)LPS（3 mg∕kg或 4 mg∕kg）經(jīng)氣管途徑進(jìn)入肺部 6～12 h，可見肺部水腫明顯且肺臟有少許出血點(diǎn)。

三組各個時間點(diǎn)的W∕D值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中時間點(diǎn)為 6、12 h 時 W∕D值均達(dá)高峰，時間點(diǎn)為24、72 h時W∕D值均呈下降趨勢。見表2。

圖1 鼻腔滴藥組不同劑量LPS、不同時間點(diǎn)肺組織的病理情況（HE，200×）

圖2 鼻腔滴藥組不同劑量LPS、不同時間點(diǎn)細(xì)支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥、肺間質(zhì)炎癥病理評分

圖3 氣管給藥組不同劑量LPS、不同時間點(diǎn)肺組織的病理情況（HE，200×）

圖4 氣管給藥組不同劑量LPS、不同時間點(diǎn)細(xì)支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥、肺間質(zhì)炎癥病理評分

圖5 腹腔給藥組不同劑量LPS、不同時間點(diǎn)肺組織的病理情況（HE200×）

圖6 腹腔給藥組不同劑量LPS、不同時間點(diǎn)細(xì)支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥、肺間質(zhì)炎癥病理評分

表2 不同時間點(diǎn)、不同劑量、不同途徑給藥后各組新生鼠左肺W∕D比值比較（n=5，±s）

表2 不同時間點(diǎn)、不同劑量、不同途徑給藥后各組新生鼠左肺W∕D比值比較（n=5，±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05

時間 鼻腔滴藥組腹腔給藥組0 h 1 h 6 h 12 h 24 h 72 h 3 mg∕kg 4.67±0.11 4.95±0.40 5.96±0.14a 6.20±0.38a 5.08±0.43 4.71±0.16 4 mg∕kg 4.73±0.12 5.03±0.21 6.08±0.18a 6.15±0.14a 4.95±0.27 5.08±0.18 5 mg∕kg 4.76±0.16 5.35±0.34 5.69±0.19a 6.04±0.00a 4.55±0.09 4.69±0.15氣管給藥組3 mg∕kg 4.71±0.15 4.79±0.10 5.80±0.26a 5.61±0.18a 4.68±0.19 4.16±0.16 4 mg∕kg 4.60±0.08 4.71±0.16 5.70±0.19a 5.72±0.14a 4.62±0.07 4.67±0.09 3 mg∕kg 4.66±0.06 4.858±0.08 5.66±0.16a 5.918±0.22a 4.692±0.14 4.54±0.09 4 mg∕kg 4.50±0.10 4.74±0.05 5.58±0.36a 6.642±0.13a 4.55±0.20 4.51±0.13 5 mg∕kg 4.77±0.35 4.78±0.16 5.92±0.24a 6.35±0.14a 4.62±0.16 4.59±0.12

表3 BALF中不同劑量LPS、不同時間點(diǎn)PMN總數(shù)比較（±s，%）

表3 BALF中不同劑量LPS、不同時間點(diǎn)PMN總數(shù)比較（±s，%）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與鼻腔滴藥組比較，bP＜0.05

時間0 h 1 h 6 h 12 h 24 h 72 h鼻腔滴藥組腹腔給藥組3 mg∕kg 2.57±0.53 4.35±0.65 9.53±0.51a 12.4±0.52a 9.32±0.47a 4.42±0.65 4 mg∕kg 3.87±0.770 4.37±70.45 10.88±1.51a 12.46±0.85a 7.55±1.19a 4.51±0.52 5 mg∕kg 3.05±0.92 4.02±0.52 10.11±1.64a 11.97±0.78a 5.87±0.94a 5.16±0.94氣管給藥組3 mg∕kg 6.498±0.34a 7.65±0.62 14.59±1.34a 16.43±1.69a 11.22±1.54a 10.39±1.68 4 mg∕kg 7.43±0.54ab 8.69±0.45 13.34±1.19a 16.69±1.67a 10.99±2.22 7.90±1.833 mg∕kg 4.90±0.79 7.59±1.09 12.13±1.17a 10.14±0.81a 7.15±0.33a 5.06±0.62 4 mg∕kg 3.68±0.56 6.24±1.09 10.84±1.08a 8.78±1.03a 7.10±0.97a 5.10±1.10 5 mg∕kg 3.90±0.78 5.95±1.04 11.95±1.92a 7.58±1.30a 7.15±0.81a 5.75±0.89

2.4 肺泡灌洗液（BALF）中多形核白細(xì)胞（PMN）計數(shù) 三組時間點(diǎn)為6、12 h時，BALF中PMN值均顯著高于對照組，24 h時PMN仍高于對照組，但較12 h時BALF中PMN值降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但1、72 h時BALF中PMN值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同給藥途徑的對照組中PMN比較，氣管滴入組中PMN值顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討 論

ALI是一種常見于重癥監(jiān)護(hù)室里的危重疾病。據(jù)統(tǒng)計，該病的死亡率約為 50%～60%[9]。然而，ALI∕ARDS 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍不清楚。目前，機(jī)械通氣是治療ALI∕ARDS的基礎(chǔ)方式，但由此導(dǎo)致的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎是增加患兒死亡的原因之一，其病原菌以革蘭陰性桿菌為主[3]。有研究表明，革蘭陰性菌（如肺炎克雷伯、大腸埃希菌）是新生兒肺部感染的主要致病菌[5]。目前，針對ALI∕ARDS發(fā)病機(jī)制的研究資料主要來源于動物模型，其中報道的ALI∕ARDS動物模型中成年鼠與新生鼠的給藥途徑不同。眾所周知，抗原進(jìn)入機(jī)體因其途徑、劑量或頻次的不同可使機(jī)體產(chǎn)生不同強(qiáng)度的免疫應(yīng)答，且過高、過低的抗原劑量可誘導(dǎo)免疫耐受，只有適中的劑量方可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

本研究比較了LPS劑量3～8 mg∕kg不同給藥途徑新生鼠的死亡率，經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給藥途徑為鼻腔滴藥和腹腔給藥時LPS劑量為3～5 mg∕kg時，新生鼠的死亡率可控制在25%以下；但給藥途徑為氣管給藥時，如果將死亡率控制在25%以下，LPS劑量范圍應(yīng)為3～4 mg∕kg。因此，本研究選擇了 LPS 劑量為 3、4、5 mg∕kg，給藥途徑為鼻腔滴藥、腹腔給藥建立肺損傷模型；而氣管給藥途徑的肺損傷模型的LPS劑量為3、4 mg∕kg，進(jìn)而對比選擇最佳肺損傷模型。

本研究結(jié)果顯示，LPS經(jīng)鼻腔途徑或腹腔注射途徑進(jìn)入新生鼠肺部時，肺部炎癥結(jié)果相似，均隨著LPS劑量的增加而加重。LPS（3 mg∕kg 或 4 mg∕kg）進(jìn)入體內(nèi) 6～12 h，肺部體積增大、炎癥明顯，且肺臟無明顯出血點(diǎn)，24 h后炎癥呈減輕趨勢。當(dāng)劑量增加至5 mg∕kg時，肺部除體積增大及炎癥細(xì)胞浸潤外，還可見大量出血點(diǎn)及胸腔積液，提示該劑量可導(dǎo)致肺出血，從而并不適合制備該模型。這與施展等[10]的研究結(jié)果相似。當(dāng)LPS經(jīng)氣管途徑注入新生鼠體內(nèi)時，肺部體積、炎癥程度也隨劑量的增加而加重，且肺臟表面可見少許出血點(diǎn)，24 h后炎癥較LPS注入前減輕。肺W∕D值可反映新生鼠予LPS后肺部水腫情況，該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS組在6～12 h W∕D值增加，但24 h后W∕D值與對照組比較無顯著差異，提示新生鼠給予LPS 24 h內(nèi)可能引起肺部血管通透性增加，導(dǎo)致肺損傷。

導(dǎo)致ALI最常見的因素是革蘭陰性菌敗血癥。SOOD等[11]將大腸埃希菌內(nèi)毒素注入新生豬體內(nèi)成功誘導(dǎo)肺部中性粒細(xì)胞聚集，產(chǎn)生肺損傷。本研究結(jié)果顯示，氣管給藥模型新生鼠肺部有大量PMN浸潤，鼻腔滴藥次之，腹腔給藥時，模型組肺內(nèi)PMN數(shù)量明顯較前二者少。這與李紅霞等[12]的研究結(jié)果相似。但值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氣管給藥途徑的對照組中PMN值較另外兩組中的對照組中PMN值得顯著增高，這可能與氣管給藥途徑需切開頸前皮膚暴露氣管后將藥經(jīng)注射器注入肺內(nèi)，屬于有創(chuàng)操作相關(guān)。

綜上所述，以上3種途徑均可成功誘導(dǎo)新生大鼠ALI∕ARDS動物模型。但氣管給藥途徑屬于有創(chuàng)操作，該操作本身可能導(dǎo)致PMN在肺部聚集，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。而腹腔注射雖可誘導(dǎo)肺部損傷，但腹腔注射LPS也可成功誘導(dǎo)膿毒血癥導(dǎo)致腎損傷，這使建立的模型可能同時存在肺、腎等臟器損傷，而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13]。鼻腔滴藥可以成功制備肺損傷模型，且其感染途徑接近臨床新生兒呼吸道感染途徑類型，故根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推薦該途徑為首選制備ALI∕ARDS動物模型。