染色體微陣列技術(shù)在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因診斷中的應(yīng)用*

熊佳麗，王晶，董一善，劉建兵，虞斌，顧建東

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州婦幼保健院1.婦產(chǎn)科，2.實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州 213000）

自然流產(chǎn)在妊娠人群中的發(fā)生率達(dá)10%～15%[1]，多為妊娠12周前的早期流產(chǎn)。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)指同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次及3次以上的自然流產(chǎn)。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，月經(jīng)失調(diào)、宮腔粘連、繼發(fā)不孕的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)不斷增加，患者及其家庭的悲傷、焦慮等不良情緒顯著增加，故目前普遍認(rèn)為連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)即應(yīng)當(dāng)重視并進(jìn)行評(píng)估。自然流產(chǎn)常見的原因包括胚胎染色體異常、免疫失衡、內(nèi)分泌異常、血栓形成傾向、生殖道畸形或發(fā)育不良、生殖道感染及宮頸機(jī)能不全等，其中胚胎染色體異常率在早期自然流產(chǎn)中約占50%～60%[2-3]。因此，胚胎或絨毛組織的染色體檢測(cè)分析對(duì)本次自然流產(chǎn)的病因診斷具有重要意義，為今后的生育指導(dǎo)提供重要信息。

染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis, CMA）是一項(xiàng)新興的以微陣列為基礎(chǔ)的染色體分析技術(shù)，對(duì)全基因組進(jìn)行掃描，可檢出拷貝數(shù)變異（copy number variation, CNV）＜1 kb的微缺失和微重復(fù)，突破了以往的細(xì)胞核型分析只能發(fā)現(xiàn)5 mb以上遺傳物質(zhì)改變的技術(shù)局限性，且無需組織或細(xì)胞培養(yǎng)，避免母體污染，故而將CMA技術(shù)應(yīng)用在自然流產(chǎn)的病因診斷中是很有指導(dǎo)意義的。本研究采用CytoScan 750K基因芯片（美國Affymetrix公司）對(duì)61例自然流產(chǎn)患者（流產(chǎn)次數(shù)≥2次）的胚胎絨毛組織進(jìn)行CMA檢測(cè)分析，探討CMA技術(shù)在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值，并對(duì)夫妻雙方再次生育進(jìn)行遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和指導(dǎo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年9月-2017年6月南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州婦幼保健院婦科就診，自然流產(chǎn)次數(shù)≥2次，經(jīng)陰道超聲確認(rèn)胚胎停止發(fā)育需行清宮術(shù)的孕婦61例，選取無菌清宮術(shù)取出的胚胎絨毛組織進(jìn)行CMA（芯片）檢測(cè)。患者年齡22～42歲，平均29.9歲；孕周6.43～13周，平均8.86周；流產(chǎn)次數(shù)2～4次。所有患者均簽署CMA（芯片）檢測(cè)知情同意書。

1.2 材料與試劑

人類組織DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司），NspⅠ酶、T4連接酶、PCR純化試劑盒、片段化及標(biāo)記試劑盒、CytoScan 750K（55萬個(gè)CNV探針+20萬個(gè)SNP探針）芯片試劑盒（美國Affymetrix公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（美國Clontech公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

雜交儀Genechip hybridization oven 645、洗滌工作 站GeneChip?Fluidics Station、 掃 描 儀GeneChip?Scanner GCS 3000Dx v.2 System均采用美國Affymetrix公司生產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

無菌清宮術(shù)中獲取的新鮮胚胎組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后，用清潔、鋒利的手術(shù)剪剪取絨毛組織約20～100 mg，置于裝有生理鹽水的1.5 ml離心管中，并于1 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。所有胚胎絨毛組織采用人類組織DNA提取試劑盒提取全基因組DNA。CMA檢測(cè)均嚴(yán)格按照Affymetrix公司提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行，具體步驟簡列如下：取250 ng胚胎絨毛組織DNA經(jīng)Nsp I酶消化為短片段，將NspⅠ消化產(chǎn)物末端補(bǔ)齊后經(jīng)T4連接酶連接上共同引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化，經(jīng)片段化及標(biāo)記后與雜交液混合均勻，變性后加載于Cyto Scan 750K芯片并置于雜交儀中50℃ 60 r/min，雜交16～18 h；經(jīng)洗滌工作站洗脫染色后用掃描儀捕獲圖像，獲取原始數(shù)據(jù)。

1.5 結(jié)果判讀

CMA獲得的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software 進(jìn)行分析。參照國際基因組CNV多態(tài)性數(shù)據(jù)庫DGV（http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、OMIM（http：//www.omim.org）、DECIPHER（http：//decipher.sanger.ac.uk）、ISCA（http：//clinicalgenome.org）等數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻(xiàn)判讀CNVs。CMA結(jié)果解讀報(bào)告嚴(yán)格按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)對(duì)基因芯片拷貝數(shù)變異結(jié)果解讀指南[5]，將CNV分為3個(gè)等級(jí)：①致病性CNV；②不確定臨床意義的CNV；③非致病性CNV。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)及率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體異常的類型及各類型分布

篩選入組的61例自然流產(chǎn)患者胚胎絨毛組織樣本進(jìn)行CMA檢測(cè)，均獲得診斷結(jié)果，檢測(cè)成功率為100%，其中36例樣本CMA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)異常結(jié)果，陽性率59.0%，包括染色體數(shù)目異常31例（86.1%），染色體結(jié)構(gòu)異常4例（11.1%），整套染色體單親二倍體1例（2.7%）。首先，在31例染色體數(shù)目異常結(jié)果中發(fā)現(xiàn)常染色體三體23例、性染色體數(shù)目異常3例、嵌合體3例及三倍體2例。本研究中發(fā)現(xiàn)的常染色體數(shù)目異常中以16三體最為多見，其次為9三體、21三體及22三體；3例性染色體數(shù)目異常均為X單體。其次，本研究中發(fā)現(xiàn)4例染色體結(jié)構(gòu)異常，包括貓叫綜合征1例、Y染色體微缺失1例及2P24.3微重復(fù)1例，另有1例12q微重復(fù)（780 kb）經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢臨床意義不確定，該例患者共自然流產(chǎn)3次，前兩次孕2個(gè)月經(jīng)陰道B超均未探及胎心。見表1。

表1 36例自然流產(chǎn)患者胚胎絨毛組織CMA檢測(cè)異常結(jié)果

2.2 染色體異常在不同孕周中的分布情況

61例樣本中，以8周前的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)最為多見，占34.4%，經(jīng)CMA檢測(cè)，其異常率也最高，達(dá)85.7%。同時(shí)，流產(chǎn)時(shí)間發(fā)生越早，胎兒染色體異常率呈增高的趨勢(shì)。見表2。

2.3 不同年齡階段的染色異常情況

高齡婦女流產(chǎn)組織染色體數(shù)目異常率高達(dá)81.8%，高于低齡婦女（81.8% vs 26.0%）（P＜0.05）。見表3。

2.4 流產(chǎn)次數(shù)與染色體異常分布情況

61例樣本中，流產(chǎn)次數(shù)為2次的患者共46例、3次為13例、4次為2例。其中以2次流產(chǎn)中出現(xiàn)染色體異常最為多見，異常率達(dá)60.9%，隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，異常率呈逐漸下降趨勢(shì)。見表4。

表2 不同孕周染色體異常分布情況

表3 不同年齡階段染色體異常比較

表4 不同流產(chǎn)次數(shù)與染色體核型異常分布情況

3 討論

CMA這一遺傳學(xué)診斷技術(shù)，最大特點(diǎn)的就是一次檢測(cè)即能夠?qū)φ麄€(gè)基因組拷貝數(shù)進(jìn)行高通量、高分辨率、高敏感性掃描和分析，能夠精確定位變異區(qū)段的位置、清除顯示該區(qū)段的內(nèi)的基因含量，并能夠?qū)蜻M(jìn)行分析，在基因水平上解釋患者的臨床表現(xiàn)，并評(píng)估預(yù)后，故CMA 能夠較其他染色體分析技術(shù)，能更有效地檢出由于染色體導(dǎo)致的流產(chǎn)，并通過對(duì)夫妻雙方相應(yīng)位點(diǎn)的檢測(cè)，對(duì)再次生育進(jìn)行遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，具有其他染色體分析技術(shù)所無法比擬的優(yōu)越性[6]。

本研究對(duì)61例流產(chǎn)樣本進(jìn)行了CMA檢測(cè)，成功率達(dá)100%。發(fā)現(xiàn)染色體異常36例，陽性率為59.0%，其中數(shù)目異常31例，占86.1%，是導(dǎo)致胚胎流產(chǎn)的主要原因。絕大多數(shù)染色體非整倍體為胚胎期致死性，其中16三體所占比例最高，其次為Turner綜合征，9、22和21三體也占較大的比例，而其他染色體三體所占比例較低。非整倍體多數(shù)在孕早期發(fā)生流產(chǎn)，16三體一般在孕早期流產(chǎn)，少數(shù)9、21三體及Turner綜合征病例流產(chǎn)可發(fā)生于孕中期甚至晚期[2-3，7]。若流產(chǎn)胚胎存在非整倍異常，那么這將是導(dǎo)致流產(chǎn)的根本原因。絕大多數(shù)染色體非整倍體為新發(fā)或者偶發(fā)，因此建議患者自然妊娠，做好常規(guī)檢查、早中孕篩查、產(chǎn)前診斷。而13、15號(hào)染色體和21、22號(hào)染色體有發(fā)生羅伯遜易位的可能，再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，故建議夫妻雙方做核型分析，以排除羅伯遜易位，對(duì)再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估[8]。孕婦年齡常為染色體數(shù)目異常的高危因素，而本組患者年齡＞35歲發(fā)生染色體數(shù)目異常共21例。因此對(duì)染色體數(shù)目異常的篩查不應(yīng)該僅僅關(guān)注高齡人群，因?yàn)檫@些異常應(yīng)該是由于非年齡因素所致。

本研究共檢出4例染色體結(jié)構(gòu)異常，占13.8%，遠(yuǎn)高于以往研究6%的結(jié)論[9]，其原因?yàn)楹诵头治龇直媛实?，?duì)染色體結(jié)構(gòu)異常的檢出率遠(yuǎn)低于CMA。2例樣本在染色體發(fā)生部分缺失和（或）重復(fù)。其中1例檢測(cè)結(jié)果顯示：①arr[hg19]5p15.33p15.2（113 576-10 720 924）×110 607 kb致病性變異；②arr[hg19]11p15.5p15.4（230 680-9 273 889）×39 043 kb 致病性變異。該患者染色體在5p15.33p15.2區(qū)段有10 607 kb片段缺失，內(nèi)含8個(gè)致病基因，11p15.5p15.4區(qū)段有9 043 kb片段重復(fù)。其臨床表現(xiàn)為：出生后尖銳的貓叫樣哭聲，智力低下，整體發(fā)育遲緩，小頭畸形及異常面容，語言發(fā)育遲緩，生長發(fā)育遲緩，并可能伴有先天性心臟病、神經(jīng)及腎臟相關(guān)的異常和畸形[10-11]。針對(duì)此類患者，考慮為流產(chǎn)兒父母雙方一方可能為4號(hào)、9號(hào)染色體的平衡易位的攜帶者。故建議雙方均需行染色體檢查，以此來確認(rèn)胎兒異常的來源并為再次妊娠提供產(chǎn)前診斷依據(jù)。

綜上所述，CMA技術(shù)用于自然流產(chǎn)胚胎組織的染色體分析成功率高，分辨率高，＞5 Mb的CNV亦能檢測(cè)出，在常規(guī)染色體核型分析中很難或不能被發(fā)現(xiàn)而導(dǎo)致漏診；其次CMA檢測(cè)對(duì)標(biāo)本取材要求遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)，不需要活細(xì)胞，可以直接提取流產(chǎn)絨毛及死胎組織，能夠提供快速、準(zhǔn)確的流產(chǎn)物全基因組分析，能夠檢測(cè)染色體數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常、嵌合體等，且無需標(biāo)本培養(yǎng)。其有效克服了現(xiàn)有其他染色診斷技術(shù)的缺點(diǎn)，準(zhǔn)確地檢驗(yàn)出常規(guī)核型能發(fā)現(xiàn)的非平衡染色體變異，以后核型技術(shù)無法檢測(cè)到的拷貝數(shù)變異，將染色體的診斷水平提高到基因水平，在遺傳學(xué)分析中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，可以讓那些發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的患者減少不必要的檢查和治療，為流產(chǎn)病因分析和對(duì)夫妻雙方再次生育指導(dǎo)提供更有價(jià)值的信息。