基質(zhì)金屬蛋白酶3-1612基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中的關(guān)系*

李永芳，李艾帆，張玉超，姜曉蕊，崔傳舉，袁樹華，賀穎，鄭紅

（1.河南大學(xué)附屬鄭州市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000；2.河南大學(xué)附屬鄭州市第一人民醫(yī)院 優(yōu)生遺傳室，河南 鄭州 450000；3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與細(xì)胞生物學(xué)系，河南 鄭州 450001）

近年來，很多研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）參與了急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke, AIS）過程中的炎癥反應(yīng)及繼發(fā)腦損傷[1]。MMPs是一族在細(xì)胞外基質(zhì)降解及再塑中發(fā)揮重要作用的鋅離子依賴的中性蛋白酶家族，研究表明其在動(dòng)脈粥樣硬化過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]，而動(dòng)脈粥樣硬化又在AIS發(fā)病程過程中扮演重要角色[4]，因此筆者推測(cè)MMPs可能通過參與動(dòng)脈粥樣硬化過程從而在AIS發(fā)揮作用。MMP-3是MMPs家族中重要成員，可激活多種MMPs的生物活性[5]，筆者推測(cè)MMP-3啟動(dòng)子-1612（5A/6A）基因多態(tài)性可能是AIS的易感因素。本研究旨在通過基因測(cè)序技術(shù)，探討MMP-3啟動(dòng)子基因多態(tài)性與AIS的關(guān)系并探討其機(jī)制，從而為AIS的遺傳易感基因提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2015年4月-2016年7月鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院并且確診的AIS患者300例及同期住院的健康個(gè)體300例，其性別、年齡均與AIS組相匹配。根據(jù)第4屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議的修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，AIS的診斷經(jīng)臨床檢查（體征、病史、CT/MRI）確診。所有研究個(gè)體之間無血緣關(guān)系。所有參與個(gè)體均已簽署知情同意書，并獲得鄭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。AIS根據(jù)TOAST分型[6]，本室將其分為5個(gè)亞組：大動(dòng)脈粥樣硬化型（LAA）、小動(dòng)脈閉塞型（SAO）、心源性栓塞型（CE）、其他明確病因型（SODE）及其他不明原因型（SUE）亞組，分別研究其與MMP-3基因多態(tài)性相關(guān)程度。排除標(biāo)準(zhǔn)：癲癇、癌癥、出血性腦血管病及肝腎功能不全者、慢性炎癥、帕金森癥及綜合征。

1.2 基因型判定

1.2.1 標(biāo)本采集及DNA的抽提 抽取所有研究患者的晨起空腹靜脈血3 ml，將其置EDTA-Na2抗凝管中，并放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩１緦?shí)驗(yàn)提取DNA所用試劑為TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒。

1.2.2 SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng) PCR引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）有限公司合成。MMP-3-1612正向引物：5'-TTCTCCATTCCT TTGATGGGGGAAAGA-3'，反向引物：5'-TTATCTGTT GGGCTCCACTGTTTCTTCC-3'。MMP-3-1612反應(yīng)條件：95℃ ×5 min，95℃ ×5 min，95℃ ×30 s，54℃ ×30 s，72℃×40 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃×7 min，4℃保存。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Tth111Ⅰ在65℃孵育24 h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料及各組間的等位基因頻率和基因型頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采用SHEsis軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，采用非條件Logisitic回歸分析，所得的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度（）及95%CI對(duì)疾病發(fā)生的相對(duì)危險(xiǎn)度及相關(guān)程度進(jìn)行研究，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較

本研究對(duì)兩組的年齡、性別等基本信息、危險(xiǎn)因素及臨床檢驗(yàn)資料進(jìn)行比較。研究結(jié)果顯示，AIS組與對(duì)照組之間在性別、年齡構(gòu)成方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)兩組之間危險(xiǎn)因素研究發(fā)現(xiàn)，AIS組危險(xiǎn)因素如高血壓、糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（簡(jiǎn)稱冠心?。┗颊叩谋壤c對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AIS組均高于對(duì)照組。兩組間的生化指標(biāo)如血糖、低密度脂蛋白、同型半胱氨酸在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 MMP-3-1612位點(diǎn)的凝膠電泳結(jié)果

野生型6A/6A基因型含有120 bp 1個(gè)條帶；5A/6A基因型含有120 bp和97 bp 2個(gè)條帶；5A/5A基因型者，只含有97 bp 1個(gè)條帶。見圖1。

表1 兩組一般臨床資料比較（n =300）

圖1 MMP-3-1612電泳圖

2.3 MMP-3-1612位點(diǎn)多態(tài)性分型結(jié)果

運(yùn)用SHEsis軟件檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MMP-3基因位點(diǎn)-1612多態(tài)性基因型分布在AIS組和對(duì)照組中處于Hardy-Weinberg平衡（P=0.837和0.103），具有群體代表性。MMP-3-1612的基因型和等位基因頻率分布結(jié)果顯示，AIS組中的5A/5A基因型數(shù)目與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AIS組高于對(duì)照組。在隱性模式中，AIS組中的5A/5A基因數(shù)目與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）AIS組高于對(duì)照組。見表2。

表2 基因型頻率與等位基因頻率在兩組間的比較 例（%）

2.4 MMP-3-1612位點(diǎn)多態(tài)性與AIS亞型的相關(guān)性

根據(jù)TOAST分型法[6]，將AIS組分為L(zhǎng)AA組（104例）、SAO組（156例）、CE組（20例）、SODE組（5例）、SUE組（15例），分別研究MMP-3-1612位點(diǎn)與不同亞型的相關(guān)性，其中SODE型分別為煙霧病2例，凝血功能障礙3例。結(jié)果顯示5A/5A基因型數(shù)目在LAA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），基因型數(shù)目有升高。見表3。

表3 AIS各亞型基因型頻率與等位基因頻率比較 例（%）

2.5 MMP-3-1612位點(diǎn)多態(tài)性基因型與腦梗死的關(guān)系

以MMP-3-1612基因多態(tài)性、低密度脂蛋白、血糖、高同型半胱氨酸、高血壓、糖尿病、冠心病為自變量，以腦梗死為因變量，采用Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示MMP-3-1612基因多態(tài)性、低密度脂蛋白升高、血糖升高、高同型半胱氨酸、高血壓、冠心病、糖尿病均可增加LAA亞型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。見表4。

2.6 MMP-3-1612位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

為檢驗(yàn)SNaPshot微測(cè)序技術(shù)分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)抽取3種基因型的部分樣本進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示，SNaPshot微測(cè)序技術(shù)的基因分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致。見圖2。

表4 MMP-3-1612位點(diǎn)的Logistic多因素回歸分析

圖2 MMP-3-1612位點(diǎn)基因型測(cè)序圖

3 討論

缺血性腦卒中的發(fā)生與環(huán)境因素和多個(gè)遺傳因素相關(guān)，基因變異也是缺血性腦卒中的重要發(fā)病因素之一。研究已經(jīng)表明腦血管疾病發(fā)生與年齡、性別、遺傳因素有關(guān)，且與高血壓、吸煙、糖尿病、高血脂癥、冠心病、高同型半胱氨酸血癥等有直接相關(guān)性[7]。、本項(xiàng)研究性別、年齡相匹配的AIS組與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，AIS組的血糖、高密度脂蛋白水平、同型半胱氨酸和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且AIS組高血壓、糖尿病、冠心病患者發(fā)病率較對(duì)照組增加，這與上述AIS的發(fā)病機(jī)制及危險(xiǎn)因素的研究結(jié)果相符。在缺血性腦卒中預(yù)防中，可注意控制血壓、血糖、血脂、同型半胱氨酸等危險(xiǎn)因素，從而減少缺血性腦卒中的發(fā)生。

MMPs在組織修復(fù)、細(xì)胞遷移、血管生成、組織形態(tài)形成及生長(zhǎng)過程中扮演重要角色，生理?xiàng)l件下，MMPs與金屬蛋白酶特定組織抑制劑之間保持平衡，如果平衡破壞可能導(dǎo)致一系列病理過程，如動(dòng)脈粥樣硬化，MMPs具有降解基質(zhì)蛋白作用，可導(dǎo)致斑塊破裂、出血形成血栓，可影響缺血性腦卒中發(fā)病過程[2-3]。MMP-3是MMPs家族重要成員，它具有廣泛的底物特異性，可降低Ⅱ、Ⅳ和Ⅸ型膠原蛋白、纖維結(jié)合蛋白、膠質(zhì)、蛋白聚糖、板層、和彈性蛋白活性，也可激活其他的MMPs，如膠原酶、基質(zhì)裂素和明膠酶-B，對(duì)結(jié)締組織重塑至關(guān)重要[8-9]。

國(guó)外的研究如BETON等[10]和GHILARDI等[1]研究發(fā)現(xiàn)MMP-3啟動(dòng)子5A/6A等位基因的6A基因與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切，其表達(dá)增加可加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。而FLEX等[11]研究MMP-3啟動(dòng)子基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者與年齡性別匹配的對(duì)照組比較，MMP-3啟動(dòng)子5A/5A基因型在病例組中高于對(duì)照組，考慮5A等位基因與急性缺血性腦卒中關(guān)系密切，是急性缺血性腦卒中危險(xiǎn)因素。國(guó)內(nèi)的研究如黃小亞等[12]研究發(fā)現(xiàn)急性動(dòng)脈硬化型腦梗塞患者M(jìn)MP-3水平增加，MMP-3啟動(dòng)子5A等位基因可能為急性動(dòng)脈硬化型腦梗死的遺傳易感基因。本研究在調(diào)整傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素后，Logistic回歸分析顯示，MMP-3-1612基因多態(tài)性可增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提示MMP-3-1612位點(diǎn)基因突變與急性缺血性腦卒中相關(guān)。并且研究發(fā)現(xiàn)AIS組5A/5A基因型個(gè)體數(shù)目較對(duì)照組增加，認(rèn)為攜帶5A/5A基因型的個(gè)體可能增加患缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這與FLEX等[11]和黃小亞等[12]的研究結(jié)果一致，而與國(guó)外研究不一致，考慮與種族差異有關(guān)。分析原因，推測(cè)可能由于MMP-3-1612 5A/5A基因?qū)е翸MP-3基因轉(zhuǎn)錄水平增高，增加了斑塊裂解，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊轉(zhuǎn)化為小且更容易破裂的斑塊，從而增加急性缺血性腦卒中發(fā)生的概率。

馬愛軍等[13]研究認(rèn)為，MMP-3-1612血清水平在LAA型腦卒中急性期升高，且5A等位基因攜帶者（5A/5A+5A/6A）患LAA型腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)大于6A/6A基因型攜帶者，認(rèn)為MMP-3-1612基因多態(tài)性與LAA型腦卒中易感性相關(guān)，而本研究對(duì)AIS組各亞型進(jìn)行分析時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)，LAA型腦梗死5A/5A基因型數(shù)目增加。而LAA型為大動(dòng)脈粥樣硬化型，動(dòng)脈粥樣硬化為發(fā)病主要原因，同樣證實(shí)5A/5A基因可能通過參與動(dòng)脈粥樣硬化過程從而增加急性缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)，但因亞組樣本有限，仍需大樣本研究證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)5A/5A基因型可能為急性缺血性腦卒中的遺傳危險(xiǎn)因素，可能成為急性缺血性腦卒中預(yù)防的重要靶點(diǎn)。但由于缺血性腦卒中是一種復(fù)雜的疾病，由多個(gè)微效易感基因及環(huán)境因素共同累加作用，且其危險(xiǎn)因素與糖尿病、冠心病等存在重疊，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。本研究急性缺血性腦卒中的易感基因，樣本含量較小，有必要在以后研究中擴(kuò)大樣本，進(jìn)行多位點(diǎn)，并進(jìn)一步研究不同地區(qū)和不同種族的人群進(jìn)行驗(yàn)證，也可進(jìn)一步從mRNA和蛋白水平進(jìn)行更深入的研究，從而更深入的研究及探明該基因?qū)毙匀毖阅X卒中發(fā)生的作用及其機(jī)制，從而為急性缺血性腦卒中的基因水平治療提供更可靠的理論依據(jù)。