一種Off/On型熒光光度法檢測魚肉中氟含量

熊海濤, 唐志華，吳迎春，龐海霞1,

1(陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中，723001) 2(陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中，723001)

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，含氟物質(zhì)與日俱增，其通常以廢氣、廢水及廢渣的形式向大氣水體土壤中排放，給生態(tài)環(huán)境帶來巨大危害[1]。因此，對氟含量的準(zhǔn)確監(jiān)測就具有重要意義。

目前，對氟定量分析的方法主要有:離子選擇電極法[2-3]、分光光度法(包括催化光度法)[4-6]、離子色譜法[7-9]、極譜法[10]、石墨爐分子吸收光譜法[11-12]及熒光光度法[13-15]等。在這些方法中，離子選擇電極與分光光度法盡管儀器簡單，操作方便，但是重現(xiàn)性均較差；離子色譜法需要較為苛刻的分離條件，極譜法會(huì)帶來一定的環(huán)境污染，而石墨爐分子吸收光譜法往往需要昂貴的儀器設(shè)備。熒光光度法具有靈敏度高、選擇性好及線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。近年來該法結(jié)合時(shí)間分辨技術(shù)、偏振技術(shù)、同步掃描和三維掃描等實(shí)驗(yàn)新技術(shù)，在食品檢測中得到廣泛應(yīng)用。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一種水溶性高分子聚合物，具有良好化學(xué)穩(wěn)定性、成膜性及保護(hù)膠體作用等。尤其是近幾年，PVP與一些納米材料相結(jié)合而制備出多種功能性復(fù)合材料[16-18]并應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域[19-20]。另外，PVP也具有一定的熒光特性[21-22]，但是未見其分析應(yīng)用方面的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用強(qiáng)酸性溶液中，F(xiàn)-競爭性結(jié)合Fe3+而使PVP-Fe3+體系熒光得到恢復(fù)，基于此特性建立了一種Off/On型熒光光度法分析氟離子含量的新方法。該方法靈敏度較高，試劑廉價(jià)易得，無二次污染。該方法有望用于生物與環(huán)境水樣中氟離子含量的批量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

F4600熒光光度計(jì),日本日立公司；HH-6型恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司；HL-3000型電子天平,日本AND公司；FW135型絞碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司；SX2-4-13型馬弗爐,上海有限微行爐業(yè)公司。

1.2 材料與試劑

PVP(美國Sigma-Aldrich公司，wt: 10000)：3.0 mmol/L；FeCl3(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)：8.0 mmol/L；KF(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)：0.1 mmol/L；醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.20 mol/L)。

氯乙酸-氫氧化鉀緩沖溶液：準(zhǔn)確稱量13.135 0 g氯乙酸和5.218 0 g KOH，用二次水溶解后移入1 000 mL容量瓶中定容；B-R緩沖液：磷酸(0.04 mol/L)、HCl(0.04 mol/L)及醋酸(0.04 mol/L)各100 mL，混合而成；

草魚、鰱魚及鯽魚：均購自漢中市漢臺(tái)區(qū)漢豐水產(chǎn)市場；

所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率18.24 MΩ·cm)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取2支10 mL比色管依次編號(hào)1、2，各加入0.5 mL PVP(3.0 mmol/L)溶液與8.0 mmol/L FeCl3溶液，2號(hào)比色管另加標(biāo)準(zhǔn)系列KF或樣品溶液，然后均用氯乙酸-氫氧化鉀緩沖溶液(pH=2.0)定容至刻度線，每支比色管振蕩3 min，再靜置30 min之后，用F4600熒光光度計(jì)分別掃描熒光光譜(1，2號(hào)比色管對應(yīng)熒光分別記為F1、F2，用熒光恢復(fù)(ΔF=F2-F1)對F-濃度做圖，通過得到的工作曲線確定樣品中F-含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVP、PVP-Fe3+及PVP-Fe3+-F-反應(yīng)體系的熒光光譜研究

按照1.3實(shí)驗(yàn)方法，分別以270 nm激發(fā)波長研究了PVP、PVP-Fe3+及PVP-Fe3+-F-三個(gè)不同反應(yīng)體系的熒光發(fā)射光譜(如圖1所示)。

圖1 不同體系熒光發(fā)射光譜圖Fig.1 Fluorescence emission spectrums of different systems注：C(PVP)=0.01 mmol/L；C(Fe3+)=0.3 mmol/L；C(F-)=0.01 mmol/L；pH=2.0；溫度(25℃)；時(shí)間(25 min)。

結(jié)果表明，3種不同體系的熒光發(fā)射波長均為544 nm，單獨(dú)PVP體系的熒光強(qiáng)度為1 860，PVP-Fe3+體系的熒光強(qiáng)度為208，說明Fe3+能在強(qiáng)酸性介質(zhì)中猝滅PVP的熒光，這與文獻(xiàn)相一致[21]。而當(dāng)PVP-Fe3+體系中加入少量的F-后，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度變?yōu)?36，這可能是基于加入的F-競爭性結(jié)合了原有反應(yīng)體系中的Fe3+而生成[FeF6]3-絡(luò)合物，致使PVP-Fe3+生成物中的PVP被釋放到溶液中，結(jié)果使體系熒光強(qiáng)度有所恢復(fù)。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1 最佳緩沖溶液確定

按照實(shí)驗(yàn)方法，用氯乙酸-氫氧化鉀緩沖溶液、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液及B-R緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)且保持其他因素不變的情況下，初步研究表明：在氯乙酸-氫氧化鉀緩沖溶液下熒光恢復(fù)ΔF值最大。因此，實(shí)驗(yàn)選擇氯乙酸-氫氧化鉀緩沖溶液作為下面研究的最佳緩沖溶液。

2.2.2 最佳pH的選擇

固定其他條件不變，取pH=1.5，2.0，2.5，3.0及3.5氯乙酸-氫氧化鉀緩沖溶液配制反應(yīng)體系溶液。由圖2可以發(fā)現(xiàn)：在pH=2.0時(shí), PVP的熒光恢復(fù)最大。這主要是由于強(qiáng)酸性介質(zhì)中不利于游離的F-存在，而較弱的酸性介質(zhì)中則不利于Fe3+的穩(wěn)定存在。因此，在以后的研究中，選擇pH=2.0的氯乙酸-氫氧化鉀緩沖溶液作為最佳pH值。

圖2 pH對相對熒光強(qiáng)度ΔF的影響Fig.2 Effect of pH on ΔF注：C(PVP)=0.010 mmol/L；C(Fe3+)=0.3 mmol/L；C(F-)=0.01 mmol/L；溫度(25℃)；時(shí)間(25 min)。

2.2.3 最佳PVP濃度的選擇

作為研究體系中的熒光探針，PVP濃度會(huì)直接影響F-的分析特性。選定加入不同濃度PVP溶液，對PVP-Fe3+及PVP-Fe3+-F-兩個(gè)體系分別進(jìn)行熒光光譜掃描。圖3表明：隨著PVP濃度的增加熒光恢復(fù)程度逐漸增大，但是當(dāng)其濃度超過0.015 mmol/L后體系的熒光恢復(fù)又逐漸減弱。這可能是由于太低濃度的PVP會(huì)得到較弱的熒光發(fā)射峰值，而過高濃度的PVP會(huì)致使少量F-存在時(shí)，恢復(fù)的體系熒光發(fā)射不明顯。因此，選擇0.015 mmol/L PVP濃度作為最佳濃度。

圖3 PVP濃度對ΔF的影響Fig.3 Effect of PVP concentration on ΔF注：C(Fe3+)=0.3 mmol/L；C(F-)=0.01 mmol/L；pH=2.0；溫度(25℃)；時(shí)間(25 min)。

2.2.4 最佳Fe3+濃度的選擇

在確定pH為2，PVP濃度為0.015 mmol/L，溫度與時(shí)間保持不變的條件下，改變Fe3+濃度以進(jìn)行反應(yīng)體系的熒光光譜掃描。由圖4可以觀察到：隨著Fe3+濃度的增大，熒光恢復(fù)程度呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢，僅當(dāng)Fe3+濃度為0.4 mmol/L時(shí)體系熒光恢復(fù)最強(qiáng)?？赡苁怯捎赑VP和F-同時(shí)對Fe3+進(jìn)行競爭反應(yīng)，較低濃度的Fe3+對PVP的熒光猝滅較弱(背景信號(hào)較高)，不利于方法靈敏度的提高，而高濃度的Fe3+與一定量PVP反應(yīng)后，溶液中存在的游離Fe3+濃度仍然較高，會(huì)導(dǎo)致因少量的F-引起的熒光恢復(fù)較弱。為此，選取Fe3+最佳濃度為0.4 mmol/L。

圖4 Fe3+濃度對ΔF的影響Fig.4 Effect of Fe3+ concentration on ΔF注：C(PVP)=0.015 mmol/L；C(F-)=0.01 mmol/L；pH=2.0；溫度(25 ℃)；時(shí)間(25 min)。

2.2.5 最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇

設(shè)定PVP-Fe3+及PVP-Fe3+-F-兩種體系溶液均反應(yīng)5、15、25、35、45及55 min后進(jìn)行熒光光譜掃描(熒光強(qiáng)度恢復(fù)研究)。圖5說明：在2種體系各自反應(yīng)35 min后，二者的熒光強(qiáng)度差異(恢復(fù))最大，再延長反應(yīng)時(shí)間，熒光恢復(fù)程度基本不變，這說明PVP和F-同時(shí)對Fe3+競爭反應(yīng)可以在35 min之內(nèi)完成。因此，選定35 min后，對兩種體系進(jìn)行熒光光譜掃描。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對ΔF的影響Fig.5 Effect of reaction time on ΔF注：C(PVP)=0.015 mmol/L；C(Fe3+)=0.4 mmol/L；C(F-)=0.01 mmol/L；pH=2.0；溫度(25℃)。

2.2.6 最佳反應(yīng)溫度的選擇

在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，考察反應(yīng)溫度對選定反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度變化的影響。由圖6可以看出：隨著溫度增加，在20～40 ℃，ΔF值基本保持不變；繼續(xù)升高反應(yīng)溫度，ΔF值逐漸下降，這可能是由于溫度過高會(huì)使PVP分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。所以，選擇在常溫下(25 ℃)對不同體系的熒光光譜進(jìn)行研究。

圖6 溫度對相對熒光強(qiáng)度ΔF的影響Fig.6 Effect of temperature on ΔF注：C(PVP)=0.015 mmol/L；C(Fe3+)=0.4 mmol/L；C(F-)=0.01 mmol/L；pH=2.0；時(shí)間(35 min)。

2.3 建議方法的分析特性

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，F(xiàn)-濃度在1.5～30.0 μmol/L與體系熒光恢復(fù)程度(ΔF)呈良好的線性相關(guān)(如圖7與圖8所示)，其回歸方程為ΔF=63 334.1C(mmol/L)+7.89, 相關(guān)系數(shù)r=0.997 5。按照國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)建議，計(jì)算方法的檢出限為0.6 μmol/L。對含有3.0 μmol/L F-的反應(yīng)體系進(jìn)行連續(xù)8次熒光光譜掃描，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

圖7 不同F(xiàn)-濃度對體系熒光強(qiáng)度的響應(yīng)Fig.7 Fluorescence emission spectra of F- withdifferent concentrations

圖8 校準(zhǔn)曲線Fig.8 Calibration curve

2.4 干擾離子考察

2.5 樣品分析

2.5.1 魚肉樣品前處理

取適量魚(包括草魚、鯉魚及鯽魚)肉并去皮、去骨，再將魚肉組織清洗干凈，然后用絞碎機(jī)將其絞碎。接著，準(zhǔn)確稱取2.000 0 g魚肉于坩堝中，加4 mL 0.5 mol/L硝酸鎂溶液與少量1.0 mol/L氫氧化鈉溶液，攪拌混勻后放置30 min(固定樣品中的氟)。然后，在水浴上揮干，再用電爐加熱炭化至不冒煙，再將其于600 ℃馬弗爐內(nèi)灰化6 h。待灰化完全，取出放冷，將灰分全部轉(zhuǎn)移至潔凈燒杯中并加高純水和少量氫氧化鈉溶解，再加入適量活性炭攪拌5 min，靜置30 min以后，先用濾紙過濾1次，將濾液經(jīng)過0.45、0.22 μm水系濾膜過濾，得到透明的所需要樣品溶液，并用緩沖溶液定容到10 mL容量瓶中備用。同樣的方法，再平行處理2份。

2.5.2 樣品測定結(jié)果及回收率

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，按照1.3實(shí)驗(yàn)方法測定樣品中F-含量，并分別添加3.0 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)樣品液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分析結(jié)果如表1所示：測得草魚、鰱魚及鯽魚樣品中F-的含量分別為1.9、3.0及2.6 μg/g，加標(biāo)回收率在93.33%～100.00%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.3%。這說明本實(shí)驗(yàn)所建立起來的方法具有較高的準(zhǔn)確度與精密度。

表1 樣品測定結(jié)果及回收率實(shí)驗(yàn)(n=3)Table 1 Determination results of samples and recovery rate (n=3)

3 結(jié)論

本文基于強(qiáng)酸性介質(zhì)中，少量F-能競爭性結(jié)合Fe3+-PVP體系中Fe3+而形成[FeF6]3-配離子，導(dǎo)致反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著恢復(fù)，據(jù)此建立了一種Off/On型熒光光度法檢測氟的新方法。采用該方法測定3種魚肉樣品中F-的最高含量為3.0 μg/g，遠(yuǎn)低于國標(biāo)中氟含量(21.0 μg/g)，說明該地區(qū)草魚受到氟污染的程度較低。該方法操作簡便、試劑廉價(jià)且無污染，有望為食品監(jiān)督與檢測部門分析本地區(qū)魚肉樣品中F-含量提供技術(shù)參考。