基于基因測序技術(shù)對辣椒醬生產(chǎn)設(shè)備和空氣中的細(xì)菌檢測

徐廷弼，鈕成拓，王琪，劉春鳳，李永仙，鄭飛云，王金晶，李崎

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

辣椒醬是我國傳統(tǒng)食品，具有營養(yǎng)豐富、色澤鮮艷、增進(jìn)食欲等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛[1]。辣椒醬在生產(chǎn)存儲過程中易出現(xiàn)染菌現(xiàn)象，從而導(dǎo)致產(chǎn)品酸敗、變色、脹氣等現(xiàn)象。辣椒醬中含有的細(xì)菌包括乳桿菌屬(Lactobacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，在辣椒醬熱炒制過程中可以殺死辣椒醬中的絕大部分微生物，但依舊存在部分芽孢桿菌屬細(xì)菌通過形成芽孢的方式留在辣椒醬中導(dǎo)致辣椒醬腐敗[2]。

傳統(tǒng)微生物鑒定方法主要通過形態(tài)觀察、革蘭氏染色及生化反應(yīng)等手段，利用伯杰氏手冊等材料進(jìn)行比對分析[3]。其操作簡便、效果直觀，但存在精度低、不適用于大批量的菌群分析鑒定等缺點(diǎn)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和測序技術(shù)成本的降低，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如變形梯度凝膠電泳[4]、宏基因組測序[5]、擴(kuò)增子測序[6]和16S rDNA測序[7]等手段，極大推動了微生物鑒定領(lǐng)域的發(fā)展。16S rDNA存在于所有細(xì)菌染色體內(nèi)，編碼16S rRNA對應(yīng)DNA序列，具有種類少、含量高且高度保守的特性。因此，采用細(xì)菌16S rDNA測序技術(shù)對樣品中的細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)鑒定的應(yīng)用具有高通量、可實(shí)現(xiàn)不可培養(yǎng)細(xì)菌的準(zhǔn)確鑒定等一系列優(yōu)勢。

辣椒醬的生產(chǎn)主要可以分為3個工段，第一階段是將鮮辣椒切碎后與食鹽混合，并將混合物置于腌漬池內(nèi)，使用循環(huán)水噴淋的方式使食鹽與辣椒充分混合。將混合后的腌漬辣椒用食鹽覆蓋表層靜置3個月后，在第二階段中將腌漬后辣椒與香料混合后于炒鍋內(nèi)于102 ℃炒制10～14 min，在最后一階段將炒制后辣椒醬注入冷卻塔內(nèi)，利用盤管冷卻后進(jìn)行包裝。辣椒醬成品的鹽度在125～150 g/L，然而依舊可能發(fā)生微生物污染事件。前期研究發(fā)現(xiàn)辣椒醬污染微生物主要為細(xì)菌[2]，然而污染微生物是如何進(jìn)入辣椒醬中的途徑仍然未知。本文針對某知名辣椒醬食品廠的工藝流程，在辣椒醬原料倉庫、炒制間和包裝間3個工段分別取樣，并采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法結(jié)合16S rDNA測序?qū)苯丰u生產(chǎn)階段設(shè)備和空氣中存在的細(xì)菌情況進(jìn)行分析，闡述辣椒醬不同生產(chǎn)工段的主要微生物，從而為辣椒醬品質(zhì)把控和安全生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母粉、胰蛋白胨:分析純，英國OXOID公司；牛肉膏、K2HPO4、檸檬酸氫二胺、乙酸鈉、葡萄糖、吐溫80、MgSO4、MnSO4、瓊脂粉:分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京TIANGEN公司；瓊脂糖、DNA Marker，上海Sangon Biotech公司；rTaq、引物，大連TaKaRa公司。

細(xì)菌培養(yǎng)采用MRS和LB兩種培養(yǎng)基。MRS培養(yǎng)基配方(g/L)：蛋白胨10、牛肉膏10、酵母粉5、K2HPO42、檸檬酸氫二胺2、乙酸鈉5、葡萄糖2、吐溫80 1、MgSO40.28 、MnSO40.14、瓊脂粉15，pH自然，115 ℃濕熱滅菌15 min；LB培養(yǎng)基配方(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10，pH自然，121 ℃濕熱滅菌15 min。由于辣椒醬為高鹽環(huán)境，因此在MRS和LB培養(yǎng)基中需要加入與辣椒醬中相同鹽濃度的NaCl。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoStat plus金屬浴，德國eppendorf公司；自動控溫空氣搖床，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司； TGL-16G臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；HVE-50全自動高壓蒸汽滅菌鍋，日本HIRAYAMA株式會社； MICROL17臺式高速離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司； GelDoc-ItTM凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司；TC5000 PCR儀，英國TECHNE公司。

1.3 方法

1.3.1 空氣及設(shè)備取樣

本實(shí)驗(yàn)采用高鹽MRS和LB瓊脂培養(yǎng)皿，取樣方法參考GB/T 18204.1—2000《公共場所空氣微生物檢驗(yàn)方法-細(xì)菌總數(shù)測定》自然沉降法。具體方法為：將培養(yǎng)皿置于生產(chǎn)車間及倉庫的4角和中央共5處，其中4角相距墻面1 m，距離地面高度1 m。將培養(yǎng)皿打開于空氣中暴露30 min, 采用無菌袋封裝后分別于37 ℃有氧和無氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h。取樣地點(diǎn)為：原料倉庫、炒制間和包裝間。

設(shè)備取樣使用無菌鑷子，于各生產(chǎn)設(shè)備內(nèi)壁刮取適量內(nèi)容物于無菌三角瓶內(nèi)。經(jīng)無菌生理鹽水稀釋后涂布于高鹽MRS和LB瓊脂培養(yǎng)皿，分別于37 ℃有氧和無氧環(huán)境下培養(yǎng)96 h。根據(jù)稀釋量與涂布量計(jì)算每克內(nèi)容物內(nèi)的細(xì)菌菌群數(shù)。

1.3.2 菌落計(jì)數(shù)及空氣中菌群密度的換算

以肉眼方式數(shù)出培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)目?？諝饩好芏扔蓨W梅梁斯基公式換算，并將單位轉(zhuǎn)為CFU/m3。根據(jù)該公式，在100 cm2表面積的培養(yǎng)皿上5 min內(nèi)沉降的菌群總數(shù)等同于10 L空氣內(nèi)的菌群總數(shù)[8]，具體公式如式(1)所示：

(1)

式中:C，空氣內(nèi)菌群總數(shù)，CFU/m3；N，培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)，CFU/皿；A，培養(yǎng)皿表面積，cm2；t，培養(yǎng)皿與空氣接觸時間，min。

1.3.3 細(xì)菌基因組DNA提取

采用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取樣品總基因組DNA，具體操作方法參考試劑盒說明書。目標(biāo)產(chǎn)物于Nanodrop微量分光光度計(jì)檢測濃度后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR反應(yīng)

16S rDNA采用50 μL PCR擴(kuò)增體系,具體組分為：rTaq25 μL；引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1541R( AAGGAGGTGATCCAG CCGCA)各2 μL；模板10 μL；雙蒸水11 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸80 s，循環(huán)30次，70 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.5 16S rDNA測序

將PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司測序。該公司測序采用Illumina技術(shù)，該技術(shù)為邊合成邊測序。在測序時以單鏈DNA為模板，合成互補(bǔ)鏈時采用的dNTP帶有熒光標(biāo)記，不同堿基熒光信息經(jīng)成像系統(tǒng)采集整合后得出目的片段的堿基序列[9]。后續(xù)數(shù)據(jù)的處理方法如下：將reads中的接頭序列和barcode序列濾掉；用flash軟件將存在overlap的reads對加以拼接；利用QIIME軟件對于拼接的數(shù)據(jù)加以過濾，過濾掉含N較多或者含低質(zhì)量堿基較多的序列；過濾掉拼接序列內(nèi)的嵌合體序列[10]。最后將拼接后的結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI Blast)進(jìn)行比對。取最相似結(jié)果，鑒定出該序列所對應(yīng)的菌株[11]。

1.3.6 細(xì)菌的產(chǎn)氣鑒定

將取樣所得單菌落用接種環(huán)挑至放置了杜氏小管的厭氧管內(nèi)，以高鹽MRS和LB培養(yǎng)基分別于37 ℃下好氧或厭氧培養(yǎng)96 h，觀察產(chǎn)氣情況，具體方法參考文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒醬生產(chǎn)工段細(xì)菌菌群計(jì)數(shù)

2.1.1 空氣中細(xì)菌菌群計(jì)數(shù)

本研究采用MRS和LB兩種培養(yǎng)基對厭氧菌和好氧菌進(jìn)行培養(yǎng)，原因基于本實(shí)驗(yàn)室先前針對同一食品廠中豆瓣醬菌群分析的研究，發(fā)現(xiàn)在改良TJA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和RCM培養(yǎng)基中，LB培養(yǎng)基針對好氧菌，MRS培養(yǎng)基針對厭氧菌有較好的分離結(jié)果[13]。

針對辣椒醬生產(chǎn)過程空氣中的細(xì)菌菌群情況，本研究對原料倉庫、炒制間和包裝間的空氣進(jìn)行了取樣并對其微生物總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。如圖1所示，辣椒醬原料倉庫、炒制間和包裝間空氣中的好氧菌菌群密度分別為3.0×102、1.3×104、8.2×102CFU/m3，而厭氧菌菌群密度分別為1.4×103、3.4×103、7.0×101CFU/m3。

圖1 辣椒醬生產(chǎn)工段空氣中好氧菌和厭氧菌菌群數(shù)Fig.1 Number of aerobic and anaerobic bacteria in theair in each working procedures

空氣內(nèi)的菌群數(shù)受到地點(diǎn)、溫度、濕度等眾多因素影響，通常而言室內(nèi)菌群數(shù)較室外高[14]。本研究中，空氣中好氧菌濃度除原料倉庫外，均高于厭氧菌菌濃度。根據(jù)實(shí)際情況，推測辣椒醬生產(chǎn)過程中好氧菌主要源自空氣流通等各種方式，厭氧菌的主要來源為辣椒醬。原料倉庫中厭氧菌菌濃高源自于該工段的生產(chǎn)模式，鹽漬辣椒采用50 kg塑料包裝由供應(yīng)商處運(yùn)至原料倉庫，通過人工卸貨方式注入暫儲池，全程為開放式操作，在注入時厭氧菌由此進(jìn)入空氣。包裝間厭氧菌、好氧菌菌群數(shù)低則是由于包裝線的密封性，且各環(huán)節(jié)均采用了包括紫外照射，定期消毒等方式進(jìn)行消毒殺菌，因此厭氧菌濃度很低。炒制間細(xì)菌菌濃顯著增高，原因在于該生產(chǎn)工序采用炒鍋對辣椒醬進(jìn)行炒制，炒制過程中產(chǎn)生高溫、高濕，其室內(nèi)平均溫度可達(dá)42.1 ℃，遠(yuǎn)高于其他工段(21.3 ℃)；相對濕度可達(dá)98%，遠(yuǎn)高于原料倉庫(65%)和包裝間(61%)，且墻壁有肉眼可見的冷凝水析出，因此該高溫、高濕環(huán)境有利于細(xì)菌大量增殖。與此同時，該環(huán)境長期用于生產(chǎn)辣椒醬，可視為一種選擇性培養(yǎng)基，對于特定細(xì)菌具有富集作用。

2.1.2 設(shè)備中細(xì)菌菌群計(jì)數(shù)

本文進(jìn)一步對辣椒醬3個生產(chǎn)工段設(shè)備上的細(xì)菌菌群進(jìn)行取樣和分析。由圖2可知，原料倉庫、炒制間和包裝間設(shè)備中的好氧細(xì)菌菌群密度分別為1.4×105、7.6×105、3.6×107CFU/g，而厭氧細(xì)菌菌群密度分別為2.1×105、8.7×105、7.4×107CFU/g。包裝間與原料車間設(shè)備中厭氧菌含量顯著高于好氧菌，其原因在于：炒制時攪拌漿帶入大量空氣，使得辣椒醬內(nèi)溶氧量上升，而溶氧量的上升會導(dǎo)致后續(xù)包裝段好氧菌的大量增殖，而原料和包裝工段均處于厭氧環(huán)境，因此厭氧菌數(shù)量高于好氧菌。此外，辣椒醬冷卻時在一段較長時間內(nèi)會維持在30～60 ℃，會促使芽孢桿菌芽孢萌發(fā)，從而使包裝線內(nèi)厭氧菌的大量增殖[15]。此解釋與包裝線內(nèi)厭氧菌中芽孢菌含量高的現(xiàn)象相符。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和多粘芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)2種芽孢桿菌即占總菌群比重64.54%。綜上，對于微生物的控制重點(diǎn)在于炒制后到灌裝這一階段，此階段內(nèi)微生物大量增殖，使其菌種的數(shù)量和種類均有大幅度提升。

圖2 各生產(chǎn)工段內(nèi)設(shè)備中好氧菌、厭氧菌群數(shù)Fig.2 The number of aerobic bacteria and anaerobes inthe equipments in each working procedures

2.2 基于16S rDNA測序的辣椒醬生產(chǎn)工段細(xì)菌菌群分析

2.2.1 不同工段空氣中細(xì)菌菌群組成

為了進(jìn)一步分析辣椒醬生產(chǎn)過程中微生物的組成情況，本研究進(jìn)一步利用16S rDNA測序技術(shù)對辣椒醬3個生產(chǎn)階段空氣和設(shè)備中的細(xì)菌組成進(jìn)行了分析。如圖3所示，本研究從辣椒醬生產(chǎn)工段空氣中共檢出6種好氧菌和16種厭氧菌。在好氧菌中，3種為芽孢桿菌，1種為葡萄球菌，2種為考克氏菌。巨大芽孢桿菌(B.megaterium)和短小芽孢桿菌(B.pumilus)在3個工段均有檢出，而枯草芽孢桿菌(B.subtilis)僅在原料倉庫內(nèi)檢出；2株考克氏菌(Kocuriasedimini,K.palastris)存在于原料倉庫和炒制間，而人類葡萄球菌(S.hominis)在包裝倉庫及包裝間檢出。在該6種好氧菌中，除考克氏菌外其余5種均可產(chǎn)芽孢[16]。3個工段的好氧菌中芽孢菌占比分別為52.31%、80.23%、100%，這表明在辣椒醬生產(chǎn)過程中芽孢菌具有相對較強(qiáng)的生命力。與此同時，本研究從辣椒醬生產(chǎn)工段空氣中篩選得到16種厭氧菌。從圖3-B可以看出，維氏鏈球菌(Straphylococcuswarneri)、頭鏈球菌(S.capitis)、人類鏈球菌(S.hominis)、木糖溶纖維素梭菌(C.xylanolyticum)和多粘芽孢桿菌(P.polymyxa)在辣椒醬所有生產(chǎn)工段均能檢出。在原料階段檢出的7種細(xì)菌菌株盡管其中部分菌株在炒制工段未檢出，但在包裝線均有檢出，其中產(chǎn)芽孢菌占比57%。原料辣椒經(jīng)過炒制后，木糖溶纖維素梭菌(C.xylanolyticum)和德氏腸球菌(Enterococcusdevriesei)所占比例分別下降89.3%、72%，而表皮葡萄球菌(S.epidermidi)和陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)所占比例,上升113%、95%。在炒制辣椒中共新檢出2種菌：催產(chǎn)克雷伯氏桿菌(Klebsiellaoxytoca)和維氏腸球菌(E.vikkiensis)。3個工段的厭氧菌中芽孢菌占比分別為28.69%、80.23%、65.00%。辣椒醬各階段樣品細(xì)菌菌群中芽孢桿菌比例高，經(jīng)過加熱后芽孢桿菌比重明顯上升，說明炒制滅菌可以殺滅細(xì)菌營養(yǎng)體而對芽孢效果較差。滅菌后非產(chǎn)芽孢菌的減少減輕了對產(chǎn)芽孢菌的競爭抑制，從而有利于產(chǎn)芽孢菌的生長[17]。

圖3 不同工段空氣中好氧菌群(A)、厭氧菌群(B)組成Fig.3 The aerobic bacteria (A) and anaerobe (B) in theair of different sections

在分離到的厭氧菌中，頭葡萄球菌(S.capitis)[18]、陰溝腸桿菌(E.cloacae)[19]、克雷伯氏桿菌(K.oxytoca)[20]、維氏腸球菌(E.vikkiensis)[21]、輕型鏈球菌(Streptococcusmitis)[22]均為條件致病菌。其中頭葡萄球菌(S.capitis)，陰溝腸桿菌(E.cloacae)和輕型鏈球菌(S.mitis)為革蘭氏陽性菌，可以考慮在炒制后加入乳酸鏈球菌素(nisin)進(jìn)行特異性抑制。乳酸鏈球菌素會導(dǎo)致革蘭氏陽性菌細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致ATP等物質(zhì)外泄并導(dǎo)致細(xì)胞溶解，同時對于孢子也有良好殺滅作用[23]。

2.2.2 不同工段設(shè)備中細(xì)菌菌群組成

本研究通過16S rDNA技術(shù)對于設(shè)備內(nèi)分離到的好氧菌和厭氧菌進(jìn)行了鑒定。如圖4-A所示，本工段共檢出好氧菌3種，分別為短小芽孢桿菌(B.pumilus)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、地衣芽孢桿菌(B.subtilis)，其中地衣芽胞桿菌為兼性厭氧菌，因此在好氧和厭氧環(huán)境下均有檢出。如圖4-B所示。共檢出6種厭氧菌，其中芽孢菌2種，為木質(zhì)纖維素梭菌(Clostridiumxylanolyticum)和多黏芽孢桿菌(P.polymyxa)，其余為非芽孢菌。其中木質(zhì)纖維素梭菌(C.xylanolyticum)、克雷伯氏菌(K.oxytoca)和多黏芽孢桿菌(P.polymyxa)在所有工段均有檢出。辣椒原料經(jīng)過炒制后，多黏芽孢桿菌(P.polymyxa)從占比13%增加至65%，并在成品中一直維持較高水平(57%)；木質(zhì)纖維素梭菌(C.xylanolyticum)由開始的32%下降至11%。值得注意的是，在6種厭氧菌中，存在維氏腸球菌(E.vikkiensis)、德氏腸球菌(E.devriesei)、陰溝腸桿菌(E.cloacae)、克雷伯氏菌(k.oxytoca)4種條件致病菌，而多粘芽孢桿菌(P.polymyxa)可以產(chǎn)細(xì)菌素，對于細(xì)菌和真菌具有抑制作用[24]。

圖4 不同工段設(shè)備中好氧菌群(A)、厭氧菌群(B)組成Fig.4 The aerobic bacteria (A) and anaerobe (B) in theequipments of different sections

2.3 各工段設(shè)備內(nèi)厭氧菌產(chǎn)氣狀況

將各工段取樣獲得的單菌落于放置了杜氏小管的高鹽MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行純培養(yǎng)96 h，根據(jù)杜氏小管內(nèi)氣體充盈情況判定各厭氧菌的產(chǎn)氣能力。產(chǎn)氣菌及其產(chǎn)氣能力見表1所示。

表1 各工段設(shè)備內(nèi)厭氧菌產(chǎn)氣狀況Table 1 Aerogens and their gas production in each section

注：“-”未檢出產(chǎn)氣菌；“+”表示氣體接近或達(dá)到杜氏小管的1/3；“++”表示氣體接近或達(dá)到杜氏小管的2/3。

在空氣中共檢出2株厭氧產(chǎn)氣菌，分別為木糖溶纖維素梭菌(C.xylanolyticum)與煙草桿菌(E.tabaci)。原料倉庫內(nèi)2者均有所檢出，占比分別為1.12%和0.45%；包裝線檢出木糖溶纖維素梭菌(C.xylanolyticum)，占比1.07%。經(jīng)過96 h的厭氧培養(yǎng)，木糖溶纖維素梭菌產(chǎn)氣1/3杜氏小管，煙草桿菌(E.tabaci)產(chǎn)氣2/3杜氏小管。設(shè)備中共檢出4株產(chǎn)氣菌，分別為陰溝腸桿菌(E.cloacae)，維氏腸球菌(E.vikkiensis)，德氏腸球菌(E.devriesei)，枯草芽胞桿菌(B.subtill)。在包裝設(shè)備總菌群中分別占比：10%、6.7%、7.1%、12.3%。厭氧菌產(chǎn)生氣體為葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生CO2[25]。

3 結(jié)論

本文利用16S rDNA測序法，結(jié)合傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿培養(yǎng)法，對辣椒醬生產(chǎn)3個工段的設(shè)備和空氣中的細(xì)菌菌群進(jìn)行了分離，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。目的在于詳細(xì)理解各工段的優(yōu)勢菌群，從而指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)進(jìn)行生物學(xué)防治，減少染菌概率。從鑒定結(jié)果來看，空氣內(nèi)檢出6種好氧菌，其中芽孢菌3種；16種厭氧菌，其中芽孢菌13種?？諝庵挟a(chǎn)氣菌3種；設(shè)備內(nèi)檢出好氧菌3種，均為芽孢菌；厭氧菌6種，其中芽孢菌2種。設(shè)備內(nèi)產(chǎn)氣菌4種。與此同時，還證明了在包裝線菌群數(shù)目有大幅提升，存在二次染菌的可能。因此應(yīng)針對以上特點(diǎn)，加強(qiáng)滅菌密度和強(qiáng)度。鑒于分離到的細(xì)菌中革蘭氏陽性菌占比較高，可以考慮在后期加入nisin進(jìn)行生物學(xué)防制，從而提高抑菌效果。