一種快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的方法

王蕊，楊鑫焱，陳思涵，潘瑞麗，吳霜，滿朝新，姜毓君

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱，150030)

黃色陰溝腸桿菌曾在1980年被更名為阪崎腸桿菌[1]，阪崎腸桿菌則在2008年被重新命名并被劃分為克羅諾桿菌屬[2]?？肆_諾桿菌屬菌株已在水、肉、蔬菜、茶葉、牛奶以及嬰幼兒配方奶粉等多種食源性制品中被發(fā)現(xiàn)[3]。1958年，英國(guó)有2名新生兒因感染了克羅諾桿菌而死亡，這是世界上第1例報(bào)道的由克羅諾桿菌屬導(dǎo)致的疾病，由此越來越多的人開始關(guān)注致病菌和嬰幼兒配方奶粉之間的關(guān)系[4-5]。因此發(fā)展一個(gè)高特異性，靈敏的快速檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的方法對(duì)降低克羅諾桿菌屬菌株的污染風(fēng)險(xiǎn)尤為重要[6]。

嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌傳統(tǒng)的檢測(cè)過程包括前增菌、選擇性培養(yǎng)基增菌、分離顯色和生化鑒定等步驟，全過程需3～7 d才能得出結(jié)果[7]。與傳統(tǒng)方法相比，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)是細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)中的里程碑[8-9]，它具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，自動(dòng)化操作以及耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌檢測(cè)中[10-11]。然而，PCR技術(shù)在實(shí)際檢測(cè)一些復(fù)雜的基質(zhì)如牛奶中的致病菌時(shí)，基質(zhì)中的脂肪和蛋白質(zhì)會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用[8-9]，因此在PCR反應(yīng)前進(jìn)行樣品的分離是十分必要的。樣品分離方法中的免疫磁分離技術(shù)因其在食品檢測(cè)中的巨大潛力而被廣泛應(yīng)用[12-14]，但是此技術(shù)需要特異性的抗體。而抗體面臨制備難度大、成本高等缺點(diǎn)，同樣限制了免疫磁分離技術(shù)的應(yīng)用。

本研究中，氨基磁珠通過氫鍵作用和靜電相互作用，可非特異性直接吸附體系中存在的微量脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)。使用磁捕獲技術(shù)結(jié)合PCR技術(shù)對(duì)目標(biāo)菌株DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)。此方法不需要使用抗體，原材料制備簡(jiǎn)單，成本低廉，且前處理時(shí)間短(1～3 h)，克服了傳統(tǒng)方法前增菌時(shí)間過長(zhǎng)(3～5 d)的弊端。此外，本研究在特異性試驗(yàn)中不僅驗(yàn)證了常見的食源性致病菌，同時(shí)也針對(duì)阪崎克羅諾桿菌的新分類驗(yàn)證了克羅諾桿菌屬內(nèi)的7株致病菌。綜上所述，本研究將氨基磁珠吸附DNA技術(shù)與PCR技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌靈敏、快速以及高特異性的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基(TSB)，胰蛋白胨大豆肉湯固體培養(yǎng)基(TSA)，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；氨基磁珠，洛陽(yáng)惠爾納米科技有限公司；Triton X-100，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；EDTA，苯酚-氯仿-異戊醇溶液，北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶K，天根生化科技有限公司；PCR引物，北京諾賽基因組研究中心；PCR Master Mix，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY200B恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；3K15臺(tái)式冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器公司；Mastersizer2000激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；Veriti梯度PCR儀，賽默飛世爾科技；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀有限公司；DYY-10C 型電泳儀，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

本研究采用阪崎克羅諾桿菌(ATCC29544)作為體系優(yōu)化及靈敏度驗(yàn)證菌株，將其接種于TSB培養(yǎng)基中，在37 ℃，150 r/min的條件下培養(yǎng)12 h，即得到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的阪崎克羅諾桿菌菌液，用于后續(xù)試驗(yàn)。同時(shí)本研究采用4株阪崎克羅諾桿菌及13株非阪崎克羅諾桿菌的菌株進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，這些菌株均參照美國(guó)模式培養(yǎng)物寄存庫(kù)(American Type Culture Collection, ATCC)官方網(wǎng)站上所提供的方法進(jìn)行活化、培養(yǎng)和保藏。

1.3.2 氨基磁珠的活化

氨基磁珠活化過程按照說明書中所述：使用前將磁珠懸浮液充分混勻，取100 μL磁珠懸浮液(含磁珠1 mg)，磁分離棄上清；加入1 mL PBS(0.01 mol/L，pH值7.4)洗滌磁珠2次，磁分離棄上清；再加入200 μL PBS，使磁珠充分分散懸浮均勻；在上述200 μL 磁珠懸浮液中，加入800 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛，室溫條件下，在樣品混合儀上振蕩活化1 h；磁分離，棄上清；用1 mL PBS清洗活化的磁珠3次；最終將活化的磁珠分散在200 μL PBS中，即得到活化的磁珠懸浮液。

1.3.3 氨基磁珠吸附檢測(cè)體系中DNA

DNA在待測(cè)體系中被釋放的過程參考文獻(xiàn)并做出適當(dāng)修改[8,15-16]：取10 mL待檢樣品在4 ℃以6 000×g的轉(zhuǎn)速離心20 min后，將沉淀重懸于含有質(zhì)量濃度為5%的Triton X-100的500 μL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA,TE)緩沖液(10 mmol/L，含有1.0 mmol/L EDTA，pH值9)中，向其中加入30 μL蛋白酶K，在56 ℃條件下孵育30 min后煮沸10 min并迅速冰浴8 min，再通過苯酚-氯仿-異戊醇溶液(體積比25∶24∶1)進(jìn)行萃取，即可得到粗提的DNA溶液。向粗提的DNA溶液中加入20 μL活化后的磁珠，60 ℃孵育搖動(dòng)30 min后，經(jīng)TE buffer清洗3次，重懸于100 μL用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3.4 PCR反應(yīng)體系的建立

本文所引用的PCR引物(5’-CGG GTT ACG CAG GGT TGA-3’; 5’-GCG GTT GCC AGT GAA TAA GAT-3’)曾被驗(yàn)證針對(duì)阪崎克羅諾桿菌的PCR檢測(cè)具有較好的特異性[17]。 PCR反應(yīng)體系如下：2×PCR Master Mix 12.5 μL，去離子水8.5 μL,引物各1 μL (10 μmol/L)以及DNA模板2 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃終延伸5 min，其中變性、退火和延伸這3步循環(huán)30次。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁珠粒度分析

利用激光粒度儀對(duì)氨基磁珠的粒徑分布進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。磁珠的平均粒徑為66.714 μm，聚合物分散性指數(shù)為0.762。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)使用的氨基磁珠粒徑分布均勻且分散性良好，磁珠表面基團(tuán)包被良好。

圖1 氨基磁珠粒度分布圖Fig.1 Distribution of diameter of amino-modifiedmagnetic nanoparticles

2.2 氨基磁珠吸附DNA過程的單因素優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 TE緩沖液的pH值優(yōu)化

本試驗(yàn)基于1.3.3所述的方法，針對(duì)其中TE緩沖液的pH值進(jìn)行了梯度優(yōu)化，8組試驗(yàn)的pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，再分別對(duì)捕獲后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果如圖2所示。

M-DNA Marker D2000；0-陰性對(duì)照；1-pH 4；2-pH 5；3-pH 6；4-pH 7；5-pH 8；6-pH 9；7-pH 10；8-pH 11圖2 TE緩沖液 pH值的優(yōu)化Fig.2 Optimization of pH value of TE buffer

當(dāng)pH ≥10時(shí)，電泳條帶較暗，表明只有少量DNA結(jié)合到氨基磁珠上。靜電相互作用是影響氨基磁珠和基因組DNA結(jié)合的主要因素，當(dāng)溶液的pH值比氨基磁珠的等電點(diǎn)(9.6)高時(shí)，氨基磁珠表面帶負(fù)電荷，不能吸引DNA與其結(jié)合，因此在pH≥10時(shí)只能出現(xiàn)微弱的電泳條帶。而當(dāng)溶液的pH值低于氨基磁珠的等電點(diǎn)時(shí)，隨著pH值逐漸變小，pH值越來越接近DNA的等電點(diǎn)(4.0)，DNA表面的負(fù)電荷也逐漸減少，磁珠吸附DNA能力變?nèi)?。結(jié)果顯示當(dāng)pH越接近等電點(diǎn)時(shí)條帶越亮，故TE緩沖液的最佳pH值為9。

2.2.2 蛋白酶K添加量的優(yōu)化

本試驗(yàn)基于1.3.3所述的方法，針對(duì)其中蛋白酶K的添加量進(jìn)行了梯度優(yōu)化，6組試驗(yàn)的蛋白酶K添加量分別為0、10、20、30、40、50 μL，再分別對(duì)捕獲后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如圖3所示。

M-DNA Marker D2000；0-陰性對(duì)照；1-0 μL；2-10 μL；3-20 μL；4-30 μL；5-40 μL；6-50 μL圖3 蛋白酶K添加量的優(yōu)化Fig.3 Optimization of the addition of proteinase K

當(dāng)?shù)鞍酌窴的添加量為30 μL時(shí)，電泳條帶最亮。當(dāng)添加量小于30 μL時(shí)，基質(zhì)中的蛋白質(zhì)不能完全去除，在一定程度上對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。而當(dāng)?shù)鞍酌窴添加量大于30 μL時(shí)，容易造成蛋白酶K降解不徹底，由于蛋白酶K本身也是一種蛋白質(zhì)，同樣會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，故30 μL為蛋白酶K的最佳添加量。

2.2.3 吸附時(shí)間的優(yōu)化

本試驗(yàn)基于1.3.3所述的方法，針對(duì)其中氨基磁珠對(duì)目標(biāo)DNA的吸附時(shí)間進(jìn)行了梯度優(yōu)化，7組試驗(yàn)的吸附時(shí)間分別為0.25、0.5、1、2、3、4、5 h，再分別對(duì)捕獲后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如圖4所示。

M-DNA Marker D2000；1-15 min；2-30 min；3-1 h；4-2 h；5-3 h；6-4 h；7-5 h圖4 吸附時(shí)間的優(yōu)化Fig.4 Optimization of the absorption time

在0.25、0.5、1 h的吸附時(shí)間里，電泳條帶清晰明亮，在大于1 h的捕獲時(shí)間里條帶呈現(xiàn)隨著時(shí)間增加逐漸變暗的變化規(guī)律，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是過長(zhǎng)的吸附時(shí)間導(dǎo)致了氨基磁珠的氧化反應(yīng)。為減少檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)考慮到奶粉基質(zhì)的復(fù)雜性，最終選擇0.5 h為最佳捕獲時(shí)間。

2.2.4 吸附溫度的優(yōu)化

本試驗(yàn)基于1.3.3所述的方法，針對(duì)氨基磁珠對(duì)目標(biāo)DNA的吸附溫度進(jìn)行了梯度優(yōu)化，6組試驗(yàn)的捕獲孵育溫度分別為40、50、60、70、80、90 ℃，再分別對(duì)捕獲后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如圖5所示。

在60 ℃的吸附溫度下電泳條帶最亮，可能原因是適宜的高溫誘發(fā)了更多雙鏈DNA打開；另一個(gè)原因可能是高溫促進(jìn)了氨基磁珠和DNA分子的運(yùn)動(dòng)，使磁珠和DNA分子更容易碰撞結(jié)合。當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí)，碰撞結(jié)合概率降低，因此條帶逐漸變暗，而當(dāng)溫度高于60 ℃，電泳條帶隨溫度升高而變暗，這是由于氨基磁珠在高溫條件下發(fā)生了氧化反應(yīng)，造成了部分磁性的損失。因此，最終選擇60 ℃為最佳吸附溫度。

M-DNA Marker D2000；1-40 ℃；2-50 ℃；3-60 ℃；4-70 ℃；5-80 ℃；6-90 ℃圖5 吸附溫度的優(yōu)化Fig.5 Optimization of the absorption temperature

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取TE緩沖液pH值、吸附時(shí)間、吸附溫度3個(gè)因素，采用3因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Scheme and results of Box-Behnken design

2.3.2 回歸方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0軟件，通過對(duì)多項(xiàng)式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：灰度平均值=165.03-4.11A-1.29B+1.20C-0.73AB+2.53AC-5.07BC-20.42A2-0.49B2-113.68C2。以電泳條帶的灰度平均值為響應(yīng)值的精簡(jiǎn)模型方差分析見表2，回歸模型差異性高度顯著。模型相關(guān)系數(shù)R2=98.40%，說明這種實(shí)驗(yàn)方法可靠，使用該方程模擬真實(shí)的3因子3水平的分析是可行的。A2和C2對(duì)灰度平均值的差異顯著，說明pH值和溫度是影響磁珠吸附DNA的重要條件。

表2 回歸模型方差與分析Table 2 Analysis of variance for the fitted quadraticpolynomial

2.3.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析

利用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)磁珠吸附DNA單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，各因素的交互作用如圖6～8所示。圖6表明pH值和時(shí)間的交互作用不顯著；圖7表明pH值和溫度交互作用較弱，與pH值方向比較，溫度效應(yīng)面曲線相對(duì)更陡，表明pH值對(duì)電泳條帶亮度的影響小于溫度對(duì)電泳條帶亮度的影響；圖8表明時(shí)間和溫度交互作用較弱，與時(shí)間方向比較，溫度效應(yīng)面曲線相對(duì)更陡，表明時(shí)間對(duì)電泳條帶亮度的影響小于溫度對(duì)電泳條帶亮度的影響。對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到磁珠對(duì)DNA的最佳吸附條件為pH 8.92、時(shí)間0.25 h、溫度60.27 ℃，在此條件下，電泳條帶最亮。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)考慮到實(shí)際操作便利以及牛奶基質(zhì)的復(fù)雜度，以pH 9.0，時(shí)間0.5 h，溫度60 ℃進(jìn)行驗(yàn)證，3次平行實(shí)驗(yàn)得到的電泳條帶灰度平均值為155.34，與理論值166.043接近。因此，響應(yīng)面法對(duì)磁珠吸附DNA條件的優(yōu)化是可行的。

圖6 Y=f(A，B)的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of Y=f(A，B)

圖7 Y=f(A，C)的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of Y=f(A，C)

圖8 Y=f(B，C)的響應(yīng)面Fig.8 Response surface of Y=f(B，C)

2.4 嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)靈敏度

將10 g嬰幼兒配方奶粉(經(jīng)國(guó)標(biāo)法檢測(cè)不含有阪崎克羅諾桿菌)溶于90 mL生理鹽水中，經(jīng)梯度稀釋后，分別取1 mL不同濃度的菌液，分別加入9 mL嬰幼兒配方奶粉稀釋液，充分混勻，獲得終濃度為105～100CFU/mL的人工污染阪崎克羅諾桿菌的嬰幼兒配方奶粉樣品。將上述樣品用本文所建立的方法檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示，當(dāng)人工污染的奶粉樣品菌液濃度為102CFU/mL時(shí)通過電泳圖能看到一條較弱條帶，而當(dāng)菌液濃度為101CFU/mL時(shí)電泳圖無條帶。因此，基于本文所建立的檢測(cè)方法，嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)靈敏度為102CFU/mL。

M-DNA Marker D2000；0-陰性對(duì)照；1-100 CFU/mL；2-101 CFU/mL；3-102 CFU/mL；4-103 CFU/mL；5-104 CFU/mL；6-105 CFU/mL圖9 人工污染奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)靈敏度Fig.9 Detection sensitivity of C. sakazakii incontaminated PIF

2.5 磁珠吸附DNA結(jié)合PCR方法的特異性分析

針對(duì)4株阪崎克羅諾桿菌以及13株非克羅諾桿菌的菌株進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3，4株阪崎克羅諾桿菌均能被特異性擴(kuò)增并呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，而其余13株非阪崎克羅諾桿菌呈現(xiàn)陰性結(jié)果，證明該方法特異性良好。

表3 實(shí)驗(yàn)用菌株及特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Bacterial strains used in this investigation and the results of specificity test

注：+, 陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果; -, 陰性檢測(cè)結(jié)果，下表同。

2.6 抗干擾試驗(yàn)

由于氨基磁珠非特異性捕獲DNA的特點(diǎn)，體系中其他干擾菌株的存在可能會(huì)影響阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)，造成假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果。因此，在終濃度為105～100CFU/mL的人工污染阪崎克羅諾桿菌的嬰幼兒配方奶粉樣品中分別混入107CFU/mL的大腸桿菌和107CFU/mL的穆斯汀克羅諾桿菌，再用本文所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如表4所示，克羅諾桿菌屬內(nèi)和屬外的干擾菌株DNA均不會(huì)對(duì)阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)造成干擾，檢測(cè)靈敏度與沒有干擾菌株時(shí)的靈敏度結(jié)果保持一致，均為102CFU/mL。由此可知，本文所建立的檢測(cè)方法抗干擾性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果不會(huì)受到體系中其他菌株DNA影響。

表4 干擾性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Table 4 Test results of interference test

3 結(jié)論

本文建立了一個(gè)快速、靈敏和高特異性的檢測(cè)方法用于檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中的阪崎克羅諾桿菌。此方法通過氨基磁珠非特異性的吸附和純化奶粉樣品中基因組DNA，再通過PCR特異性擴(kuò)增并最終通過瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測(cè)結(jié)果。傳統(tǒng)的免疫磁珠分離技術(shù)需要特異性的抗體，面臨抗體制備難度大、成本高等問題。而本文通過氨基磁珠和DNA之間的氫鍵作用和靜電相互作用，使DNA能在復(fù)雜的基質(zhì)中被氨基磁珠直接吸附，避免了抗體的使用，降低了檢測(cè)成本；同時(shí)本試驗(yàn)只需要1～3 h的前處理過程，克服了傳統(tǒng)方法的3～5 d前增菌時(shí)間過長(zhǎng)的弊端。本研究通過優(yōu)化磁珠吸附過程中的TE緩沖液的pH值、蛋白酶K添加量、吸附時(shí)間和吸附溫度，提高了檢測(cè)的效果。在優(yōu)化條件下，本方法對(duì)于人工污染嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)102CFU/mL。此外，本文所建立的檢測(cè)方法對(duì)常見的食源性致病菌及克羅諾桿菌屬中非阪崎克羅諾桿菌均無交叉反應(yīng)，同時(shí)阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)不會(huì)受到體系中存在的其他菌株DNA的影響。因此，此方法可以作為一種快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的有效手段。