高濃玉米秸稈堿法預(yù)處理及半同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝研究

連戰(zhàn)，呂志飛，劉彬，劉欣，李喬丹，田冰，莊倩倩，劉同軍

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南，250353)

對石油日益增長的依賴、化石燃料的日益枯竭以及全球變暖帶來的對溫室氣體減排的需要使得由可再生資源生產(chǎn)燃料變得日益重要。而木質(zhì)纖維素因為其高含糖量，較高的可用性以及較低的價格成為主要的潛在生物煉制原料[1]。與傳統(tǒng)的生物質(zhì)煉制原料相比，木質(zhì)纖維素避免了食物與能源之間的競爭，通過生物轉(zhuǎn)化的方式利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)氣體以及液體燃料也被認(rèn)為是最具前景的生產(chǎn)可再生燃料的方式[2]。而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄物玉米秸稈因其在中國較高的生物質(zhì)收益量而被認(rèn)為是合理的生物質(zhì)乙醇生產(chǎn)原料。目前，降低生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的成本對大規(guī)模生產(chǎn)生物質(zhì)乙醇至關(guān)重要。這其中就包括選擇合適的預(yù)處理、酶解及發(fā)酵方式[3]。

堿過氧化氫法預(yù)處理能通過破壞木質(zhì)纖維素結(jié)晶區(qū)，使孔隙率和內(nèi)表面積增大，同時去除木質(zhì)素，因而能有效破除酶解轉(zhuǎn)化可發(fā)酵糖的生物質(zhì)壁障。研究表明，在pH值11.6附近，較高過氧化氫添加量下，堿過氧化氫法在有效去除木質(zhì)素的同時能最大限度地減小纖維素的損失，因而應(yīng)用較為廣泛[4-5]。對于酶解過程，使用表面活性劑能有效提高幾種木質(zhì)纖維素酶解的轉(zhuǎn)化率[6-8]，非離子型表面活性劑對酶解效率提升效果明顯，且吐溫20與吐溫80表現(xiàn)優(yōu)于其他非離子型表面活性劑[9-10]。然而傳統(tǒng)的對于表面活性劑對生物質(zhì)轉(zhuǎn)化可發(fā)酵糖的研究多集中在相對較低的底物濃度，對于高濃度底物條件下表面活性劑對木質(zhì)纖維素酶解的影響研究相對較少，而高濃度底物條件下酶解不僅能獲得高糖濃度，而且能有效提高單位設(shè)備利用率，減少能耗與廢水排放量，降低酒精分離過程成本，對于纖維素乙醇的工業(yè)生產(chǎn)有重要意義[6-8]。

發(fā)酵方式對于纖維素乙醇生產(chǎn)有著同樣重要的影響。研究表明，在相同的預(yù)處理條件下，與傳統(tǒng)的分步發(fā)酵方式相比，同步糖化發(fā)酵與半同步糖化發(fā)酵方式發(fā)酵效率明顯較高。同步糖化發(fā)酵與半同步糖化發(fā)酵過程能及時消耗產(chǎn)生的葡萄糖，從而避免了葡萄糖的高濃度積累對酶解反應(yīng)的反饋抑制[11-14]。

本文在堿性過氧化氫預(yù)處理的基礎(chǔ)上，結(jié)合酶解過程特性、吐溫20在高濃玉米秸稈酶解及發(fā)酵過程的作用以及高濃玉米秸稈半同步糖化發(fā)酵的基本條件的優(yōu)化，對高濃玉米秸稈半同步糖化發(fā)酵工藝進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與酶

玉米秸稈來自山東濰坊(粉碎機(jī)粉碎成粉過40目篩,纖維素含量35.83%，半纖維素含量17.69%)，實驗所用的纖維素酶(cellic CTecII)以及半纖維素酶(cellic HTecII)來自丹麥諾維信公司，其他化學(xué)試劑均購于國內(nèi)試劑公司，為分析純試劑。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

發(fā)酵使用菌種為安琪高活性干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司)。

培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏5， pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2 主要方法

1.2.1 堿性過氧化氫預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取 3.0 g 玉米秸稈置于50 mL三角瓶中，稱取0.3 g NaOH顆粒，加適量蒸餾水溶解，向混勻的NaOH溶液中加入H2O2溶液，ω(H2O2/玉米秸稈)=10%，將混合均勻的NaOH溶液加入盛有玉米秸稈樣品的三角瓶中，混勻后加入H2O2溶液，并補(bǔ)水至實驗設(shè)計底物濃度。置于30 ℃恒溫振蕩器中振搖，并調(diào)節(jié)pH值至11.5～11.7，每隔1 h用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)1次，使pH值保持在11.5～11.7范圍內(nèi)24 h。

1.2.2 酶解

預(yù)處理結(jié)束后，向裝有預(yù)處理玉米秸稈的三角瓶添加72% H2SO4調(diào)節(jié)pH值至5.2，按照實驗設(shè)計的酶蛋白添加量(纖維素酶∶半纖維素0.77∶0.23)分別加入一定量的纖維素酶和半纖維素酶(50 mg/g總蛋白/纖維素)，置于50 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中酶解24 h。酶解結(jié)束后，沸水浴滅活10 min，于12 000 r/min下離心3～5 min，取上清液1 mL測定單糖濃度。

1.2.3 底物濃度與玉米秸稈酶解糖得率關(guān)系

為確定適宜的酶解底物濃度，在上述實驗條件下分別考察酶解底物濃度 50、100、150、200、250、300 g/L下酶解效率的變化。

1.2.4 吐溫20對高濃玉米秸稈酶解的影響

首先通過單因素實驗確定酶解過程吐溫20最適添加量。精確稱量13.5 g AHP預(yù)處理后玉米秸稈于500 mL三角瓶中，200 g/L底物濃度，預(yù)處理完畢后分裝至25 mL具塞小瓶中，分裝為5組，每組3個平行。每組分別添加0%、1%、2%、4%、6%、8%、10%(ω)量的吐溫20，按照1.2.2方法進(jìn)行酶解，24 h后取樣測定。

在確定最適吐溫20添加量的基礎(chǔ)上，監(jiān)測酶解時間與糖得率的關(guān)系，以確定半同步糖化發(fā)酵的預(yù)酶解結(jié)束時間。取15 g玉米秸稈于500 mL三角瓶中，按照1.2.1方法預(yù)處理24 h后添加最適添加量的吐溫20，參照1.2.2進(jìn)行酶解，分別于3、5、7、9、11、15、24、36、48 、72 和96 h取樣測定糖濃度，平行實驗3組，同時設(shè)置不添加吐溫20組進(jìn)行酶解取樣作為對照組。

1.2.5 吐溫20對酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇得率的影響

配制300 mL的液態(tài)活化培養(yǎng)基(YPD)，121 ℃滅菌后，分裝至50 mL三角瓶中，每瓶20 mL，每組3個平行，分別添加0、0.1(2%，5 g/L)、0.25(5%，12.5 g/L)、0.4(8%，20 g/L)、0.5 g(10%,25 g/L)吐溫20,接入安琪高活性干酵母，然后放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱 34 ℃，170 r/min 下進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后取樣測定乙醇含量。

1.2.6 酵母生長曲線的測定

配制50 mL 的液態(tài)活化培養(yǎng)基(YPD)，121 ℃滅菌后，接入安琪高活性干酵母，然后放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱34 ℃，170 r/min下進(jìn)行培養(yǎng)。分別在培養(yǎng) 2、4、6、8、12、16、24、36和48 h時吸取部分發(fā)酵液，稀釋一定倍數(shù)并在 600 nm 下測定 OD 值。通過Origin 7.5對OD600值和時間進(jìn)行 Logistic 非線性擬合，即得到生長曲線。經(jīng)生長曲線確定酵母接種齡為16 h。培養(yǎng)完畢，于超凈工作臺將菌液倒入50 mL離心管，8 000 r/min、25 ℃離心15 min后去除上清液，接種菌體。

1.2.7 玉米秸稈半同步糖化發(fā)酵條件的優(yōu)化

在預(yù)酶解過程條件及半同步糖化發(fā)酵酵母種齡、吐溫20添加量確定的基礎(chǔ)上，對高濃玉米秸稈半同步糖化其他條件：時間與溫度進(jìn)行優(yōu)化。準(zhǔn)確稱量15 g玉米秸稈，預(yù)處理完畢并121 ℃滅菌后，根據(jù)上述實驗確定的參數(shù)，添加吐溫20進(jìn)行酶解，酶解一段時間后從恒溫振蕩培養(yǎng)箱中取出，冷卻至室溫后于超凈工作臺中接種一定接種齡，離心收集菌體的酵母(種子液酵母接種量0.1 g)。接種完畢置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，分別考察30、32、34、36、38 ℃以及72 h、7 d發(fā)酵條件下糖濃度、乙醇濃度及乙醇轉(zhuǎn)化率。

1.2.8 糖濃度與乙醇濃度的測定

酶解與發(fā)酵結(jié)束后，取1 mL樣液置于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心3 min，離心完畢取上清液100 μL，蒸餾水稀釋10倍后經(jīng)0.2 μm水系濾芯過濾加入進(jìn)樣管，高效液相色譜測定葡萄糖、木糖濃度與乙醇濃度，并計算轉(zhuǎn)化率。高效液相色譜條件為：HPX-87H色譜柱，流動相為5 mmol/L H2SO4，柱溫65 ℃，流速0.6 mL/min，檢測器為示差檢測器。

1.2.9 計算方法

纖維素-葡萄糖、半纖維素-木糖酶解轉(zhuǎn)化率及纖維素-乙醇理論轉(zhuǎn)化率分別按公式(1)、(2)、(3)計算。

(1)

(2)

(3)

式中： 0.9為纖維素到葡萄糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.88為半纖維素到木糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.511為葡萄糖到乙醇的生化計量系數(shù)；葡萄糖、木糖、底物、乙醇濃度單位均為g/L，底物質(zhì)量單位為g，纖維素及半纖維素含量單位為%。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物濃度與玉米秸稈酶解糖得率關(guān)系

如圖1所示，隨著底物濃度逐漸增加，葡萄糖以及木糖濃度逐漸提高，而相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸下降。逐步升高的底物濃度水平帶來的是酶解阻礙的增加，液體黏度逐步升高，游離水減少，酶解過程釋放的對香豆酸、阿魏酸等酶活抑制物濃度升高，酶解難度也因此逐步增加[12]。在200 g/L底物濃度下，糖得率增長速度達(dá)到峰值，葡萄糖濃度為60.35 g/L，木糖濃度為29.08 g/L，相應(yīng)的纖維素-葡萄糖轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到80.93%，半纖維素-木糖轉(zhuǎn)化率為77.2%，繼續(xù)提高底物濃度，糖得率增幅較小。其他的一些研究得出的最適底物濃度也與該研究結(jié)果接近[3,15]。該底物濃度下較少的游離水也利于預(yù)處理后進(jìn)行小體系的分裝，選擇200 g/L作為進(jìn)一步實驗研究的底物濃度。

A-糖濃度變化曲線；B-轉(zhuǎn)化率變化曲線圖1 底物濃度對玉米秸稈酶解糖得率的影響Fig.1 The effect of biomass loading on sugar yields duringenzymatic hydrolysis of corn stover

2.2 吐溫20對玉米秸稈酶解糖得率的影響

圖2顯示了不同劑量吐溫20對玉米秸稈酶解效率的影響，在0～8%添加量范圍內(nèi)，隨著吐溫20添加量的增加，葡萄糖得率逐漸提高，在8%達(dá)到最高，在該添加量下，葡萄糖轉(zhuǎn)化率較不添加吐溫20組高8.5%，糖得率得到顯著提升。一些研究表明，在料液比較低的情況下，添加吐溫20促進(jìn)酶解的最適添加量為2.5 g/L，但這些研究反應(yīng)體系的底物濃度普遍低于200 g/L：JESSICA等的反應(yīng)體系為固液比1∶8(g∶mL)的蔗渣，TORNY等人研究的反應(yīng)體系為1∶30的云杉，而周麗東的反應(yīng)體系為1∶15的木薯桿，3者換算成以底物計算吐溫20添加量分別為50、75、100 g/L，3者結(jié)果相差不大，同時與本實驗結(jié)果接近，表明吐溫20促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解的最適添加量與底物量有直接關(guān)系，而反應(yīng)體系固液比對其影響較小[5,7-8]。

圖2 吐溫20添加量對玉米秸稈酶解轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 The effect of Tween 20 addition on sugar conversionduring enzymatic hydrolysis of corn stover

對于吐溫20提高酶解轉(zhuǎn)化率的原因，TORNY研究表明,吐溫20對酶解效率的提高與降低木質(zhì)纖維素對酶的非特異性吸附有直接的關(guān)系，進(jìn)一步研究表明這種提升是由于木質(zhì)纖維素表面的木質(zhì)素與非離子型表面活性劑之間的疏水作用釋放了非特異性吸附的酶[7]。進(jìn)一步增加吐溫20添加量，纖維素轉(zhuǎn)化率反而下降，吐溫20過量的添加以及相對較低的振蕩速率可能會導(dǎo)致體系存在分層現(xiàn)象以及吐溫20分子對酶分子的包裹，從而導(dǎo)致酶解效率的相對降低。進(jìn)一步結(jié)合酵母發(fā)酵實驗確定最適吐溫20添加量。

2.3 吐溫20對高濃玉米秸稈96 h內(nèi)酶解效率變化的研究

如圖3和圖4所示，酶解初期，較高的底物濃度下，游離水較少，隨著酶解的進(jìn)行，木質(zhì)纖維素吸附的自由水被逐漸釋放出來，酶解時間3 h，液化明顯，相應(yīng)的糖濃度在3～9 h迅速增加，液化逐漸加快，且添加吐溫20組酶解效果優(yōu)于不添加吐溫20組；隨著酶解的進(jìn)行，大量的纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖進(jìn)一步積累，吐溫20組轉(zhuǎn)化率提升幅度明顯加快，吐溫組與對照組糖濃度與轉(zhuǎn)化率差距逐步加大；在11～15 h逐步進(jìn)入平臺期，較高的糖濃度抑制了酶解反應(yīng)的高效進(jìn)行，同時木質(zhì)素對酶分子的非特異性吸附導(dǎo)致部分酶無法有效發(fā)揮作用，逐步升高的酶活抑制物濃度也抑制了酶的活性[16]，糖濃度與轉(zhuǎn)化率增速放緩，在15 h，吐溫組與對照組之間糖得率差值達(dá)到最大，此時吐溫組葡萄糖與木糖轉(zhuǎn)化率為76.75%，65.65%，高于對照組轉(zhuǎn)化率9.08%，3.93%。在15～24 h，糖得率增速進(jìn)一步放緩；48～72 h轉(zhuǎn)化率變化趨于平緩，進(jìn)一步延長酶解時間，轉(zhuǎn)化率提升有限。結(jié)果表明，吐溫20對酶解效率的提升作用在經(jīng)歷逐步提升、逐步下降、保持穩(wěn)定3個過程，對酶解效率的提高不會因時間的延長而消失。9 h，吐溫組葡萄糖與木糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到24 h酶解效率的87%(分別為70.62%，60.98%)，酶解效果較好，故選擇9 h為半同步糖化發(fā)酵預(yù)酶解周期。

圖3 添加吐溫20玉米秸稈96 h內(nèi)糖濃度-時間曲線圖Fig.3 The time curve of sugar concentration in 96 h afterthe addition of Tween 20

圖4 添加吐溫20玉米秸稈96 h內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)化率-時間曲線圖Fig.4 The time curve of glucose conversion in 96 h afterthe addition of Tween 20

2.4 吐溫20對酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

吐溫20對酵母發(fā)酵的影響如圖5所示，在2%以內(nèi)，隨著添加量的增加，轉(zhuǎn)化率逐步提高。高于2%，轉(zhuǎn)化率逐步下降，但降幅較小，10%添加量較2%添加量轉(zhuǎn)化率下降0.76%，但仍高于對照組2.66%。表明在酵母發(fā)酵過程中添加適量吐溫20對于酵母活性有提高的作用，但過量添加會影響酵母活性。在酶解實驗中初步確定的5%吐溫20添加量在酵母發(fā)酵中與2%添加量效果相差較小，故5%吐溫添加量可行。

圖5 吐溫20添加量對酵母發(fā)酵乙醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 The effect of Tween 20 addition on ethanol yieldin yeast fermentation

2.5 玉米秸稈添加吐溫20半同步糖化發(fā)酵條件的優(yōu)化

溫度對玉米秸稈半同步糖化發(fā)酵乙醇得率的影響如圖6所示，乙醇得率隨溫度提高逐步提升，在34 ℃達(dá)到最大值，此時乙醇濃度為23.4 g/L，乙醇理論轉(zhuǎn)化率為75.78%，繼續(xù)提高溫度，乙醇得率開始下降，38 ℃時下降明顯。溫度對半同步糖化過程影響較大，不僅影響酵母菌發(fā)酵葡萄糖轉(zhuǎn)化乙醇的過程，同時對纖維素酶酶解效率有影響，當(dāng)溫度明顯升高，纖維素酶酶活隨之提高，進(jìn)而導(dǎo)致酶解糖得率的提升，但酵母利用葡萄糖能力隨逐步升高的溫度而明顯下降，進(jìn)而導(dǎo)致乙醇得率的降低[13,16-17]。故34 ℃作為高濃玉米秸稈半同步糖化發(fā)酵溫度較適宜。

圖6 發(fā)酵溫度對半同步糖化發(fā)酵乙醇濃度的影響Fig.6 The impact of fermentation temperature onethanol concentration of SSSF

發(fā)酵時間對于乙醇得率有著顯著影響，延長發(fā)酵時間有助于提升乙醇得率。如圖7所示，在34 ℃下，發(fā)酵時間為72 h時，對照組與吐溫組乙醇含量與乙醇轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了10.89 g/L，35.68%；11.87 g/L，38.91%，吐溫組在糖得率與乙醇轉(zhuǎn)化率方面均優(yōu)于對照組，但相對較低的乙醇得率與較高的葡萄糖殘留量，表明酵母菌未能對酶解過程釋放的葡萄糖進(jìn)行充分利用，需要對同步糖化時間進(jìn)行延長。

A-糖濃度；B-乙醇得率圖7 72h/7d半同步糖化發(fā)酵糖濃度與乙醇得率圖Fig.7 Sugar concentration and ethanol yields in 72 h/7 d-SSSF

發(fā)酵7 d，對照組同步糖化發(fā)酵后乙醇含量達(dá)到22.58 g/L，乙醇理論轉(zhuǎn)化率73.13%，與對照組相比，添加5%吐溫20后乙醇得率略有提升，乙醇含量與轉(zhuǎn)化率分別提升了1.06 g/L，3.41%。JESSICA等使用Na2SO3與NaOH預(yù)處理蔗渣，在質(zhì)量濃度40 g/L Na2SO3、質(zhì)量濃度20 g/L NaOH、2.5 g/L(相當(dāng)于底物質(zhì)量的2%)吐溫20添加量下進(jìn)行酶解及半同步糖化發(fā)酵，乙醇理論轉(zhuǎn)化率為39.5%，較對照組(不添加吐溫20)提升14.5%，提升效果顯著，但其反應(yīng)體系底物濃度僅為1∶8(g∶mL)，與高濃度底物體系存在較大差異，高底物濃度下固形物的增加直接導(dǎo)致傳質(zhì)難度的上升，進(jìn)而影響乙醇的產(chǎn)生，可能是導(dǎo)致本次實驗結(jié)果提升效果遜于JESSICA研究結(jié)果的主要原因[5]。與同步糖化發(fā)酵72 h相比，發(fā)酵周期為7 d，對照組與吐溫組乙醇得率分別提高了11.69 g/L，11.77 g/L，轉(zhuǎn)化率提升了104.96%，96.71%(與發(fā)酵72 h相比)。殘留葡萄糖含量降低到9.56 g/L，8.83 g/L。繼續(xù)延長發(fā)酵時間意義不大。

3 結(jié)論

堿過氧化氫法預(yù)處理玉米秸稈最適底物濃度為200 g/L，在該底物濃度下預(yù)處理及酶解能保證轉(zhuǎn)化率與糖濃度均處于較高水平；添加適量吐溫20能有效提高高濃玉米秸稈酶解糖得率，這種提升在酶解24 h后趨于穩(wěn)定，而吐溫20添加量與底物量密切相關(guān)；吐溫20在提高酶解轉(zhuǎn)化率的同時，對于酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇效率也有明顯提升，并對高濃玉米秸稈半同步糖化發(fā)酵乙醇得率有提升效果；溫度與時間對于玉米秸稈半同步糖化發(fā)酵影響顯著，對于利用釀酒酵母進(jìn)行半同步糖化發(fā)酵，最適溫度為34 ℃。

本研究以玉米秸稈作為底物，通過考察其酶解過程特性以及吐溫20對酵母發(fā)酵的影響、酵母的接種齡、半同步糖化發(fā)酵預(yù)酶解時間，半同步糖化發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度，確定了 AHP預(yù)處理高濃玉米秸稈的半同步糖化發(fā)酵工藝。在該工藝條件下進(jìn)行半同步糖化發(fā)酵，理論乙醇轉(zhuǎn)化率接近80%。