動(dòng)態(tài)高壓微射流協(xié)同糖基化處理對(duì)β-乳球蛋白熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的影響

謝雅雯,涂宗財(cái),*,張露,王振興,楊萍,邵艷紅,沙小梅,王輝

1(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330022) 2(南昌大學(xué),食品與科學(xué)技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047)

蛋白質(zhì)作為食品中的重要組成成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)特性[1]。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg)作為乳清蛋白中一種重要的組成部分，約占44%～50%，是一種球形蛋白。它具有結(jié)合視黃醇、VE、甾醇類(lèi)化合物及部分脂肪酸等生理功能，并且擁有極佳的氨基酸比例和豐富的必需氨基酸[2]。但是其變性溫度較低則限制了在食品工業(yè)中的應(yīng)用，因此增大β-Lg的熱變性溫度則尤為迫切和必要。

目前，對(duì)食品蛋白進(jìn)行改性以提高其加工性能或功能活性已成為食品工業(yè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，蛋白質(zhì)常用的改性方法包括多種，例如酶解法，物理方法和化學(xué)方法等。近年來(lái)，針對(duì)于蛋白質(zhì)改性的研究逐漸增多，特別是非熱加工技術(shù)(如高壓、超聲波、脈沖電場(chǎng)、微波、動(dòng)態(tài)高壓微射流等)結(jié)合糖基化反應(yīng)的復(fù)合方法越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)改性，以提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。例如OBOROCEANU等[3]發(fā)現(xiàn)脈沖電場(chǎng)能有效促進(jìn)乳清分離蛋白和葡聚糖的羰氨反應(yīng)，提高乳清分離蛋白的溶解性和乳化特性；BU等[4]研究了溫度變化對(duì)于β-Lg抗原性的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度變化為50～90 ℃時(shí)，其抗原性也逐漸升高，當(dāng)溫度大于90 ℃時(shí)，其抗原性顯著下降。ZHONG等[5]采用動(dòng)態(tài)高壓微射流與糖基化反應(yīng)對(duì)β-Lg進(jìn)行復(fù)合修飾，發(fā)現(xiàn)這種復(fù)合改性方法能改變?chǔ)?Lg的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致β-Lg的免疫特性發(fā)生變化。

動(dòng)態(tài)高壓微射流(dynamic high pressure microfluidization，DHPM)是一種特殊形式的超高壓均質(zhì)技術(shù)，是以超高壓理論、流體力學(xué)理論、撞擊流理論為基礎(chǔ)，集輸送、混合、粉碎、加壓等多種單元操作于一體的新興高壓加工技術(shù)[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，DHPM協(xié)同半乳糖糖基化改性能有效提升β-Lg的乳化性，降低其致敏性、表面疏水性和內(nèi)源熒光強(qiáng)度，使其α-螺旋含量升高，β-折疊含量降低[7]。但目前關(guān)于DHPM協(xié)同多糖糖基化改性β-Lg的研究還少見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以多糖(葡聚糖)和β-Lg為研究對(duì)象，研究DHPM協(xié)同多糖糖基化處理對(duì)β-乳球蛋白的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)分析DHPM預(yù)處理對(duì)β-Lg-葡聚糖糖基化程度的影響，為加工改性β-Lg在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料和試劑

β-乳球蛋白、葡聚糖，美國(guó)Sigma公司；其他所需試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

微射流均質(zhì)機(jī)(M-7125型 Microfluidics型)，美國(guó)Microfluidics公司；熒光光譜儀(F-7000型)，日本日立公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(U-2910型)，日本日立公司；圓二色譜儀(MOS-450型)，法國(guó)Bio-Logic SAS公司；酶標(biāo)分析儀(SynergyH1型)，美國(guó)Bio Tek公司；DSC差示量熱掃描儀(F3-200型)，德國(guó)耐馳儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DHPM處理

將β-Lg溶于pH 8.0，0.01 mol/L的PBS溶液中，采用DHPM分別在不同壓力下(0、40、80、120 MPa)對(duì)β-Lg溶液處理3次，再與葡聚糖按1∶1的質(zhì)量比混合，冷凍干燥后-20℃儲(chǔ)藏備用。最終得到的樣品分別表示為β-LgX(代表經(jīng)DHPM預(yù)處理的β-Lg體系，X分別為0、40、80、120 MPa，下同)和β-LgDX(經(jīng)DHPM預(yù)處理的β-Lg葡聚糖體系)。

1.2.2 糖基化反應(yīng)

稱(chēng)取等量的β-Lg、β-LgDX樣品置于裝有飽和KI溶液的帶蓋玻璃樣品瓶中，烘箱中55 ℃下干熱反應(yīng)10 h，烘箱中的環(huán)境濕度穩(wěn)定在65%，糖基化反應(yīng)10 h結(jié)束后將離心管置于冰水中終止反應(yīng)，最后于-20 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)藏，待測(cè)。

1.2.3 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

采用差示掃描量熱儀測(cè)量β-Lg糖基化產(chǎn)物的熱變性溫度[8]。精確稱(chēng)取6.0 mg樣品于樣品鋁盒中，掃描速度為10 ℃/min，掃描溫度為30～120 ℃?？毡P(pán)作參比，得DSC掃描曲線。

1.2.4 游離氨基含量的測(cè)定

采用鄰苯二甲醛法測(cè)定樣品中自由氨基的含量[9-10]。取100 μL樣品與2 mL OPA試劑(含0.8 g/L OPA、20 g/L SDS、38 g/L硼砂、2 g/L β-巰基乙醇)于試管中混勻，37 ℃溫浴反應(yīng)2 min后于340 nm處測(cè)量吸光度，用同體積蒸餾水代替實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。以賴(lài)氨酸(0～0.1 mg/mL)為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中游離氨基的含量(mg/mL)。

1.2.5 褐變程度的測(cè)定

取DHPM協(xié)同糖基化處理后的樣品溶解成2 mg/mL蛋白溶液濃度，再采用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液在294和420 nm處的吸光度[11]。

1.2.6 表面疏水性(H0)的測(cè)定

采用ANS熒光探針?lè)y(cè)定不同條件處理后的β-Lg表面疏水性的變化。取4 mL 0.1～1 mg/mL蛋白樣品與20 μL 8 mmol/L ANS溶液(0.01 mol/L，pH 8.0)混合，然后測(cè)定其熒光強(qiáng)度。測(cè)定條件：發(fā)射光譜波長(zhǎng)范圍為400～600 nm，激發(fā)光譜波長(zhǎng)為370 nm，發(fā)射和激發(fā)的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為1 200 nm/min，電壓為400 V。以蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，對(duì)曲線采用線性回歸分析進(jìn)行擬合，曲線斜率的計(jì)算結(jié)果則為蛋白樣品的表面疏水性(H0)[12]。

1.2.7 自由巰基含量的測(cè)定

采用ELLMAN的試劑分析方法測(cè)定不同條件處理后的β-Lg自由巰基含量[13]。將DHPM協(xié)同糖基化處理后的樣品配成1 mg/mL蛋白溶液，之后取250 μL樣品與500 μL 0.01 mol/L的DTNB混勻(0.1 mol/L，pH 8.0磷酸鹽緩沖液配制)，37 ℃反應(yīng)20 min后于412 nm處測(cè)吸光值。自由巰基的計(jì)算見(jiàn)公式(1)：

(1)

式中：A412，412 nm處的吸光度;D，稀釋倍數(shù);C，樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.2.8 圓二色譜(circular dichroism，CD)分析

根據(jù)CHEN等[14]的方法對(duì)不同條件處理后的β-Lg和β-LgD體系進(jìn)行CD分析。將凍干后的樣品用蒸餾水配制成0.1 mg/mL，然后采用光路長(zhǎng)為0.1 cm的圓形石英比色皿進(jìn)行遠(yuǎn)紫外CD分析。掃描范圍為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min，譜帶寬度為1.0 nm，環(huán)境溫度為22 ℃，每個(gè)樣品測(cè)3次，測(cè)量值以橢圓率([θ], degree·cm2/dmol)表示，具體的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量使用在線分析軟件(DichroWeb)分析，網(wǎng)址為：http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml。

1.2.9 內(nèi)源熒光強(qiáng)度的測(cè)定

用F-7000型熒光光譜儀測(cè)定各個(gè)條件處理下β-Lg熒光強(qiáng)度的變化。參照LUCIA等[15]的方法，測(cè)定條件：發(fā)射光譜波長(zhǎng)范圍為300～450 nm，激發(fā)光譜波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射和激發(fā)的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為1 200 nm/min，電壓為400 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析(p<0.05)，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱穩(wěn)定性分析

差示掃描量熱法是在程序自動(dòng)的升溫、恒溫或降溫階段下，測(cè)定樣品和參照物之間溫度與熱量差的關(guān)系，對(duì)于物質(zhì)熱變性的研究已經(jīng)較為廣泛[16]。常用測(cè)量曲線中峰頂?shù)臏囟茸鳛闃悠纷冃詼囟?，變性溫度越大熱穩(wěn)定性越大，變性溫度越小說(shuō)明其熱穩(wěn)定性越小。由圖1-A可知，經(jīng)DHPM預(yù)處理后，樣品的峰形發(fā)生較大的變化，熱峰的高度先是降低，隨著處理壓力的進(jìn)一步增大，β-Lg的熱峰高度也慢慢回升，壓力越大，峰形也越大；β-Lg的熱變性溫度也隨處理壓力的增大呈先降低后升高的趨勢(shì)，由天然β-Lg的73.48 ℃先降至66.66 ℃后升高至78.96 ℃，這與DHPM對(duì)乳清蛋白[17]和花生蛋白[18]的影響趨勢(shì)較為相似。以上結(jié)果說(shuō)明了，40 MPa的動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)降低了β-Lg的熱穩(wěn)定性，同時(shí)也降低了變性所需要的能量，而隨著壓力增大，其熱穩(wěn)定性又逐漸升高，變性所需要的能量也逐漸增大。因此，DHPM處理后的β-Lg處于一個(gè)更不穩(wěn)定的狀態(tài)，可能是因?yàn)橛胁糠窒嗷プ饔昧υ獾狡茐?，?Lg分子發(fā)生了部分變性。

通過(guò)比較圖1-A和圖1-B可知，糖基化后β-Lg的熱穩(wěn)定性明顯提升，β-LgD和β-Lg的熱變性溫度分別為77.28 ℃和73.48 ℃，DHPM 80 MPa預(yù)處理的糖基化β-Lg具有最高的變性溫度，達(dá)82.37 ℃；而β-LgD40和β-LgD120的熱變性溫度低于80 MPa預(yù)處理樣品的熱變性溫度，但仍高于未處理的β-Lg以及DHPM處理下的β-Lg最高(78.96 ℃)的熱變性溫度，這表明糖基化反應(yīng)能顯著提升β-Lg的熱穩(wěn)定性。CHEVALIER 等[19]報(bào)道， β-Lg與不同的糖發(fā)生糖基化反應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)β-Lg構(gòu)象發(fā)生變化，β-Lg的變性溫度升高。CHEN等[20]研究表明β-Lg與還原糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后β-Lg的變性溫度要高于未發(fā)生糖基化反應(yīng)的β-Lg。這可能是因?yàn)橐话闱闆r下，一個(gè)三維蛋白質(zhì)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)是由非共價(jià)相互作用中的各種吸引力和推斥力以及少數(shù)的二硫鍵所組成，而變性就需要破壞這些相互作用，糖基化后蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化，變性所需要的相互作用力也就變得更大。

圖1 DHPM不同壓力預(yù)處理對(duì)β-Lg(A)和β-Lg-葡聚糖體系(B)熱穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of DHPM pre-treatment at various pressureson the thermal stability of β-Lg(A) and β-Lg-dextran system(B)

2.2 游離氨基含量分析

糖基化反應(yīng)是蛋白質(zhì)的氨基與碳水化合物的羰基通過(guò)共價(jià)鍵相互交聯(lián)形成糖蛋白的化學(xué)反應(yīng)，常用游離氨基含量的變化來(lái)表示蛋白質(zhì)與糖接枝反應(yīng)的程度。由圖2可知，天然β-Lg的游離氨基含量隨著DHPM預(yù)處理壓力的增大呈先減小后增加的趨勢(shì)，并且在80 MPa時(shí)達(dá)到最低，為2.55 mg/mL。

圖2 DHPM不同壓力預(yù)處理對(duì)β-Lg-葡聚糖體系游離氨基含量的影響Fig.2 Effects of DHPM pre-treatment at various pressureson the content of free amino groups of β-Lg-dextran system

經(jīng)過(guò)DHPM協(xié)同糖基化處理后，β-Lg糖基化產(chǎn)物的游離氨基含量明顯低于未糖基化的β-Lg，β-LgD的游離氨基含量為為2.69 mg/mL，而β-Lg則為2.89 mg/mL；且其含量隨著處理壓力的增大呈先下降后升高的趨勢(shì)，并且在80 MPa時(shí)達(dá)到最低，為2.29 mg/mL，說(shuō)明DHPM預(yù)處理能夠促進(jìn)β-Lg的糖基化反應(yīng)。這可能是因?yàn)镈HPM處理使β-Lg去折疊，同時(shí)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，使β-Lg的結(jié)構(gòu)達(dá)到不同程度的展開(kāi)，結(jié)構(gòu)變得更為分散，更多的賴(lài)氨酸(Lys)殘基暴露到分子表面與糖的醛基共價(jià)交聯(lián)，發(fā)生羰氨縮合反應(yīng)[21-23]。當(dāng)DHPM壓力為120 MPa時(shí)，游離氨基含量又略有增加，為2.31 mg/mL，可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)再度發(fā)生聚集。

2.3 褐變程度分析

糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度通常被用來(lái)描述糖基化進(jìn)程，糖基化反應(yīng)中初級(jí)產(chǎn)物的形成量可以用294 nm處的吸光度來(lái)評(píng)價(jià)；而反應(yīng)的終極產(chǎn)物的形成量則可以用420 nm處的吸光度來(lái)評(píng)價(jià)[24]。DHPM處理和DHPM預(yù)處理協(xié)同糖基化反應(yīng)對(duì)β-Lg的褐變程度的影響如圖3所示。

A-294 nm處吸光值；B-420 nm處吸光值圖3 DHPM不同壓力預(yù)處理對(duì)β-Lg-葡聚糖體系的褐變程度的影響Fig.3 Effect of DHPM pre-treatment at various pressures onthe browning intensity of β-Lg-dextran system

樣品在294 nm處的吸光度與420 nm處的吸光度變化趨勢(shì)大致相同。DHPM預(yù)處理協(xié)同糖基化的β-Lg產(chǎn)物在294 nm和420 nm的吸光度明顯高于DHPM處理的β-Lg。當(dāng)DHPM單獨(dú)進(jìn)行處理時(shí)，β-Lg在294 nm處的吸光值變化較小，在420 nm處的褐變程度變化趨勢(shì)隨著DHPM壓力的增大呈先增大后減少趨勢(shì)，在80 MPa時(shí)達(dá)到最大。

DHPM協(xié)同糖基化處理時(shí)，40 MPa預(yù)處理結(jié)合糖基化的β-Lg的褐變程度與0 MPa時(shí)的糖基化產(chǎn)物的褐變程度明顯增加，294 nm和420 nm處的吸光值分別由0.80和0.048升高到1.00和0.056；當(dāng)處理壓力為80 MPa時(shí)，294 nm和420 nm處的吸光度分別為1.09和0.062，說(shuō)明80 MPa的DHPM處理能夠明顯增大β-Lg的糖基化程度；而當(dāng)處理壓力為120 MPa時(shí)，兩處的吸光值又稍稍降低，低于80 MPa卻仍高于40 MPa，分別為1.07和0.059。說(shuō)明DHPM 80 MPa預(yù)處理對(duì)β-Lg-葡聚糖糖基化反應(yīng)有最大的促進(jìn)作用，因此生成的糖基化產(chǎn)物也最多。所以，DHPM預(yù)處理可以促進(jìn)β-Lg-葡聚糖的糖基化反應(yīng)，這可能是因?yàn)棣?Lg經(jīng)DHPM處理后其結(jié)構(gòu)趨于展開(kāi)狀態(tài)[25-26]，高壓誘導(dǎo)的去折疊態(tài)可提高蛋白質(zhì)的反應(yīng)活性[27]。

2.4 表面疏水性分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性(H0)作為蛋白質(zhì)表面與水溶液環(huán)境接觸的疏水基團(tuán)的重要參數(shù)，在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中占有主導(dǎo)地位，對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究非常重要[28]。DHPM預(yù)處理結(jié)合糖基化反應(yīng)對(duì)β-Lg表面疏水性的影響如圖4所示。

圖4 DHPM不同壓力對(duì)β-Lg-葡聚糖體系表面疏水性的影響Fig.4 Effects of DHPM pre-treatment at various pressureson the surface hydrophobicity in β-Lg-dextran system

由圖4可知，隨著DHPM處理壓力的逐漸增大，β-Lg的表面疏水性明顯升高，且在80 MPa處理壓力下具有最高的表面疏水性為59.11，原因可能是DHPM處理使β-Lg內(nèi)部的疏水性區(qū)域外翻暴露到分子表面，與疏水性探針ANS結(jié)合，使其表面疏水性增加。同時(shí)從圖4可以看出，未經(jīng)過(guò)糖基化處理的β-Lg明顯高于經(jīng)過(guò)糖基化處理后的β-Lg的H0值，說(shuō)明糖基化反應(yīng)會(huì)改變?chǔ)?Lg的空間構(gòu)象，降低其表面疏水性，原因一方面可能是糖基化反應(yīng)會(huì)使分子中外翻的疏水性基團(tuán)包埋在其內(nèi)部；另一方面是親水性的葡聚糖與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面親水性基團(tuán)的增加，從而降低了蛋白質(zhì)的表面疏水性[29]。

2.5 自由巰基含量分析

巰基基團(tuán)是蛋白質(zhì)中很重要的功能性基團(tuán)，屬于維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的弱次級(jí)健, 能相互交聯(lián)形成二硫鍵來(lái)維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，因此對(duì)其功能性質(zhì)的發(fā)揮具有很重要的作用，屬于蛋白質(zhì)中重要的功能性基團(tuán)。每個(gè)β-Lg單體中都含有5個(gè)半胱氨酸殘基，2個(gè)二硫鍵(Cys 66-Cys 160、Cys 106-Cys 199)和1個(gè)自由巰基(Cys 121)，其中游離的第121位半胱氨酸是包埋在β-Lg分子內(nèi)部[30]。圖5是不同條件處理對(duì)β-Lg自由巰基含量的影響。由圖5可知，天然β-Lg的自由巰基含量最低，為39.91 μmol/g，隨著DHPM壓力的增大，β-Lg中的巰基含量呈先增大后降低的趨勢(shì)，并在80 MPa時(shí)達(dá)到最大，為42.06 μmol/g。由此可知，DHPM處理會(huì)誘導(dǎo)β-Lg去折疊，導(dǎo)致其巰基含量上升，這與MONAHAN等[31]的研究結(jié)果類(lèi)似。

圖5 DHPM不同壓力對(duì)β-Lg-葡聚糖體系自由巰基含量的影響Fig.5 Effects of DHPM pre-treatment at various pressureson the free sulfhydryl groups of β-Lg-dextran system

與天然和DHPM預(yù)處理β-Lg相比，DHPM協(xié)同葡聚糖糖基化處理能顯著增加β-Lg的自由巰基含量。當(dāng)預(yù)處理壓力由0 MPa增加到80 MPa時(shí)，β-LgD的自由巰基含量由39.07增加到43.22 μmol/g。但預(yù)處理壓力為120 MPa時(shí)，β-LgD體系中的自由巰基含量較80 MPa有所降低，但仍高于0 MPa，為41.23 μmol/g。因此，DHPM 80 MPa預(yù)處理樣品具有最高的自由巰基含量。以上結(jié)果表明，DHPM協(xié)同糖基化處理能引起β-Lg蛋白質(zhì)分子不斷“溶脹”發(fā)生去折疊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基基團(tuán)不斷暴露，內(nèi)部的二硫鍵暴露到分子表面，促使巰基含量顯著上升。

2.6 β-Lg的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圓二色譜可以用來(lái)檢測(cè)β-Lg的二級(jí)結(jié)構(gòu)，解析DHPM處理和糖基化反應(yīng)對(duì)β-Lg二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。DHPM處理后β-Lg的CD譜圖如圖6-A所示，二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與比例如表2所示。β-Lg是以β-折疊為主的蛋白質(zhì)，由分子C端上的一個(gè)主要的α-螺旋和9條反平行的β-折疊構(gòu)成[32]，這與表中數(shù)據(jù)相符。由表2可以看出，DHPM處理對(duì)β-Lg二級(jí)結(jié)構(gòu)的各組分含量有顯著影響，其β-折疊和α-螺旋的百分含量隨DHPM壓力的增大呈先升高后降低的趨勢(shì)，并且β-轉(zhuǎn)角的百分含量均減少，無(wú)規(guī)則卷曲的百分含量均增加。當(dāng)DHPM壓力為40 MPa時(shí)，β-折疊含量達(dá)到最大，為35.0%，但當(dāng)處理強(qiáng)度進(jìn)一步增大時(shí)，β-折疊含量開(kāi)始下降，無(wú)規(guī)則卷曲增加。由于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)不僅取決于其氨基酸序列，還與蛋白質(zhì)不同基團(tuán)之間的相互作用力有關(guān)，如氫鍵、靜電相互作用、范德華力[33]，因此DHPM處理會(huì)改變?chǔ)?Lg二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且β-折疊與無(wú)規(guī)則卷曲相互轉(zhuǎn)化。

圖6 DHPM協(xié)同糖基化處理后β-Lg(A)和β-Lg-葡聚糖體系(B)的CD譜圖Fig.6 CD spectra of β-Lg(A) and β-Lg-dextran(B)treated by DHPM pre-treatment combined with glycation

圖6-B為DHPM協(xié)同糖基化處理后的β-Lg的CD譜圖，表2中為其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與比例。如表2所示，與天然β-Lg相比，糖基化會(huì)降低β-Lg中α-螺旋的百分含量，但DHPM協(xié)同糖基化處理后的β-折疊均高于天然β-Lg，但β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的百分含量均呈現(xiàn)明顯降低趨勢(shì)，并均在80 MPa時(shí)達(dá)到最低，分別為21.1%和29.1%。40 MPa和120 MPa DHPM預(yù)處理結(jié)合糖基化樣品分別具有最高β-折疊百分含量(37.3%)和最低的α-螺旋百分含量(11.1%)。這說(shuō)明DHPM協(xié)同糖基化處理過(guò)程β-Lg的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，4種結(jié)構(gòu)之間會(huì)相互轉(zhuǎn)換，可能是因?yàn)楫?dāng)β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲百分含量減小時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)會(huì)更加穩(wěn)定，從而提高了β-Lg的熱穩(wěn)定性。

表2 DHPM處理和DHPM預(yù)處理結(jié)合糖基化對(duì)β-Lg-葡聚糖二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of DHPM treatment and DHPM pre-treatment combined with glycation on the secondary structure of β-Lg

2.7 內(nèi)源性熒光分析

內(nèi)源熒光強(qiáng)度通常被用來(lái)檢驗(yàn)蛋白質(zhì)分子的3級(jí)結(jié)構(gòu)。分子中具有3種熒光特性基團(tuán)，分別為色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)，β-Lg的內(nèi)源熒光主要來(lái)源于色氨酸殘基(Trp 19和Trp 61)，因其對(duì)于微環(huán)境細(xì)微變化十分敏感，所以可以用Trp殘基作為β-Lg的內(nèi)源熒光探針來(lái)分析蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[34-35]。由圖7-A可看出，經(jīng)過(guò)DHPM單獨(dú)處理后的β-Lg熒光強(qiáng)度增大，且隨著DHPM壓力的增大而逐漸增大。

DHPM不同壓力預(yù)處理對(duì)β-LgD體系的內(nèi)源熒光強(qiáng)度光譜圖的影響如圖7-B所示。由圖7-B可知，天然β-Lg的內(nèi)源熒光強(qiáng)度為5 075，經(jīng)糖基化反應(yīng)后β-Lg的熒光強(qiáng)度明顯下降；而經(jīng)DHPM預(yù)處理協(xié)同糖基化反應(yīng)后，β-Lg的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度隨DHPM壓力的增加先減少而后增加，且最大吸收峰處的波長(zhǎng)發(fā)生了3 nm以上的紅移，80 MPa預(yù)處理的β-LgD反應(yīng)產(chǎn)物的內(nèi)源熒光強(qiáng)度最低，僅為3 764，為未處理樣品的74%。這可能是由于糖基化反應(yīng)改變了β-Lg的結(jié)構(gòu)，Trp 19和Trp 61暴露到親水環(huán)境中引起熒光猝滅，并且這種復(fù)合處理迫使β-Lg結(jié)構(gòu)展開(kāi)，從而引起內(nèi)源性熒光光譜最大吸收峰處的波長(zhǎng)發(fā)生紅移[36]。然而，隨著DHPM壓力的進(jìn)一步增大，蛋白發(fā)生折疊，迫使β-Lg蛋白的Trp 19和Trp 61殘基再次埋到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，導(dǎo)致120 MPa時(shí)的熒光強(qiáng)度再度增加。

圖7 DHPM處理(A)和DHPM預(yù)處理結(jié)合糖基化(B)對(duì)β-乳球蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.7 Effect of DHPM treatment(A) and DHPM pre-treatment combined with glycation(B) on the intrinsicfluorescence of β-Lg

3 結(jié)論

(1)DHPM預(yù)處理協(xié)同糖基化反應(yīng)可提高β-Lg的熱穩(wěn)定性，當(dāng)壓力為80 MPa時(shí)達(dá)到最大。糖基化反應(yīng)后，β-Lg的游離氨基含量明顯降低，褐變程度明顯升高；隨著DHPM處理壓力的增大，β-Lg-葡聚糖反應(yīng)體系的游離氨基含量和褐變度分別呈先減少后增加和先增大而后減小的趨勢(shì)，且分別在80 MPa具有最低值和最高值。說(shuō)明糖基化程度隨著DHPM預(yù)處理的壓力變化而變化，DHPM 80 MPa預(yù)處理時(shí)樣品的糖基化程度最高，熱穩(wěn)定性最大。

(2)DHPM預(yù)處理會(huì)增加β-Lg的H0，80 MPa處理樣品具有最高的H0，而糖基化反應(yīng)會(huì)大大降低其H0；DHPM預(yù)處理使β-Lg的自由巰基含量升高，糖基化可再次提高其自由巰基含量，并且在80 MPa時(shí)達(dá)到了最大；圓二色譜分析證明β-Lg的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化；內(nèi)源熒光則表明了β-Lg的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其強(qiáng)度隨著壓力增大呈先降低后升高的趨勢(shì)，并且120 MPa時(shí)與40 MPa時(shí)的內(nèi)源熒光強(qiáng)度無(wú)大致變化，說(shuō)明隨著壓力增大，蛋白質(zhì)再度發(fā)生聚集。同時(shí)內(nèi)源熒光強(qiáng)度與糖基化程度的變化趨勢(shì)相反。

綜上，DHPM預(yù)處理結(jié)合葡聚糖糖基化反應(yīng)能改變?chǔ)?Lg的結(jié)構(gòu)，增大其熱穩(wěn)定性，DHPM 80 MPa預(yù)處理樣品具有高的糖基化程度和熱穩(wěn)定性，為提高β-Lg熱穩(wěn)定性的最佳處理壓力。