蚓激酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及其發(fā)酵條件優(yōu)化

江鵬，湯斌

1(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

蚓激酶(Lumbrokinase，LK)是從蚯蚓體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一組同時(shí)具有纖溶活性和激酶活性的絲氨酸蛋白酶[1]。該酶能夠刺激纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶，從而催化纖維蛋白，起到溶血栓作用[2]。臨床試驗(yàn)表明，蚓激酶還可用于預(yù)防和治療冠心病、腦梗塞、肺心病和下肢深靜脈血栓等疾病[3-4]。該酶穩(wěn)定性良好，酶制劑既能口服，亦可注射，已得到廣泛應(yīng)用[5-6]。目前，市售蚓激酶主要來源于蚯蚓粉末的提取純化，此法所得產(chǎn)品純度較低且產(chǎn)量少。因此，通過異源表達(dá)生產(chǎn)高純度的蚓激酶已成為未來蚓激酶工業(yè)化生產(chǎn)的趨勢(shì)[7]。

近年來，研究者已從不同種類蚯蚓中克隆得到蚓激酶編碼基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，但目的蛋白多以包涵體形式存在，因而沒有纖溶活性[8-11]。相較于原核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有胞外分泌且易于純化目的蛋白的優(yōu)勢(shì)[12-14]。趙明明[15]等首次在畢赤酵母中成功表達(dá)了蚓激酶F238基因，酶活最高為100 U/mL。隨后，宋馨宇[16]等人通過G418抗性梯度篩選獲得1株耐高抗性的GS115-pPIC9K-F238菌株，搖瓶培養(yǎng)84 h后達(dá)蚓激酶酶活峰值257.6 U/mL。然而，目前蚓激酶在畢赤酵母中表達(dá)研究的報(bào)道較少，且表達(dá)量較低，遠(yuǎn)不能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[15-16]。

為了提高蚓激酶在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的產(chǎn)量，本文從重組菌誘導(dǎo)表達(dá)條件出發(fā)，優(yōu)化初始菌體量、pH和溫度，并研究氨基酸對(duì)蚓激酶在酵母中表達(dá)的影響，最終通過高密度發(fā)酵手段實(shí)現(xiàn)蚓激酶基因在畢赤酵母中的大量表達(dá)，為今后蚓激酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蚯蚓樣本：獲自校園土壤中，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)鑒定為赤子愛勝蚓。本文所用E.coliJM109、畢赤酵母GS115、pPIC9K質(zhì)粒均為安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵研究中心保藏菌種，pMD18-T載體購自上海Sangon公司。Trizol試劑、尿激酶、購自上海Sangon公司，牛血纖維蛋白原、凝血酶購自Sigma公司，其他試劑購自國(guó)藥。

1.2 蚓激酶基因的克隆及表達(dá)

利用Trizol法提取赤子愛勝蚓總RNA，試劑盒法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索蚓激酶編碼序列，經(jīng)比對(duì)分析設(shè)計(jì)引物對(duì)Primer 1-F+Primer 1-R。以cDNA為模板克隆目的基因，并將其連接pMD18-T載體，送上海生工測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物對(duì)Primer 2-F+Primer 2-R。PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒同時(shí)用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化E.coliJM109，篩選得到重組質(zhì)粒pPIC9K-lks2送上海生工測(cè)序。引物見表1。利用SacI酶對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，利用MD平板進(jìn)行篩選，并提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。挑取MD平板上的酵母單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)18 h。按1%量接種于30 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600值為2～6，離心去上清收集菌體，將菌體重懸于 30 mL BMMY 培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24 h加體積分?jǐn)?shù)0.5%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

注：下劃線為酶切位點(diǎn)。

1.3 蚓激酶活力測(cè)定方法

本文采用國(guó)標(biāo)法[17](纖維蛋白平板法)測(cè)定蚓激酶活力：制備纖維蛋白平板，將梯度濃度的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣于纖維蛋白平板上，放置10 min后移入37 ℃培養(yǎng)箱，保溫18 h取出測(cè)量溶圈垂直的2個(gè)直徑，并計(jì)算2個(gè)直徑的乘積，重復(fù)測(cè)定3次，求平均值。以測(cè)定不同濃度的溶圈垂直直徑乘積(A)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品尿激酶濃度(C)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為：lnA=0.864lnC+2.047 7，R2=0.969 8。

1.4 蚓激酶畢赤酵母重組菌的發(fā)酵條件優(yōu)化

基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY，誘導(dǎo)溫度30℃，裝液量30%，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，甲醇添加量體積分?jǐn)?shù)為0.5%。誘導(dǎo)初始菌體量?jī)?yōu)化：初始OD600分別為0.5、1、1.5、2和2.5，取發(fā)酵液上清以纖維平板法測(cè)纖溶活力。誘導(dǎo)pH值的優(yōu)化：在上述優(yōu)化基礎(chǔ)上，調(diào)整初始pH值分別為4.5、5、5.5、6、6.5和7，以纖溶活力確定最佳pH值。誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化：上述優(yōu)化基礎(chǔ)上，設(shè)置初始溫度分別為26、28、30、32、34 ℃，同樣根據(jù)纖溶活力確定最佳誘導(dǎo)溫度。

氨基酸對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響：在BMMY培養(yǎng)基中分別添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%的不同種類氨基酸，對(duì)照組不加氨基酸，誘導(dǎo)84 h后取樣檢測(cè)酶活力。

1.5 重組畢赤酵母發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

1.5.1 種子培養(yǎng)

一級(jí)種子液：挑取MD平板上的重組菌，接于10 mL YPD中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)18 h，OD600值為12左右。

二級(jí)種子液：按1%的接種量取一級(jí)種子液接于350 mL BMGY中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600值為6～7。

1.5.2 發(fā)酵過程控制

10 L發(fā)酵罐裝液量6.5 L，培養(yǎng)基為BSM培養(yǎng)基，添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%的絲氨酸，PTM1添加量為4 mL/L培養(yǎng)基，通過氨水調(diào)節(jié)pH 5.0。將二級(jí)種子液接入發(fā)酵罐中，根據(jù)畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行菌體的前期培養(yǎng)，控制DO為40%，發(fā)酵pH值為5.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，通氣量為0.5 vvm，罐壓0.08 MPa。待菌體濕重達(dá)到200 g/L左右后，停止流加甘油。溶氧上升后，饑餓培養(yǎng)0.5 h，開始甲醇誘導(dǎo)。誘導(dǎo)過程嚴(yán)格控制甲醇流加速率使DO在40%小幅波動(dòng)，氨水調(diào)節(jié)pH值控制在5.5，誘導(dǎo)溫度28 ℃，通氣量為0.6 vvm，罐壓控制在0.08 MPa。

1.5.3 菌體初始濃度優(yōu)化

將450 mL二級(jí)種子液離心，去上清，用100 mL BMMY培養(yǎng)基洗勻菌體，全部接入發(fā)酵罐中，取發(fā)酵液離心測(cè)得菌體濕重為3±0.5 g/L，以此為基準(zhǔn)，通過控制加入的二級(jí)種子液的量來使得接種后發(fā)酵罐中菌體初始質(zhì)量濃度分別為3±0.5、6±0.5、9±0.5和12±0.5 g/L，培養(yǎng)條件均一致。發(fā)酵過程每隔12 h取樣，測(cè)菌體濕重和蚓激酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚓激酶基因的克隆及分析

目前在GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的蚓激酶編碼序列共有19條，其中F238基因[17-19](GeneBank No. DQ202401)的相關(guān)研究最多。本文從赤子愛勝蚓中擴(kuò)增得到蚓激酶基因lks2，全長(zhǎng)738 bp，編碼246個(gè)氨基酸(圖1-A)。比對(duì)結(jié)果顯示，lks2與F238基因同源性為99.59%，其中第136、175和398位堿基不同，導(dǎo)致編碼的46和59位氨基酸發(fā)生差異(圖2)。

圖1 蚓激酶基因克隆(A)、表達(dá)載體雙酶切(B)和重組菌基因組PCR(C)Fig.1 Lumbrukinase gene cloning (A), expression vectordouble enzyme cutting (B) and recombinant bacterialgenome PCR (C)

圖2 lks2基因與F238基因的差異Fig.2 The difference between lks2 gene and F238 gene

2.2 蚓激酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)

將lks2與pPIC9k質(zhì)粒相連接，雙酶切驗(yàn)證結(jié)果顯示表達(dá)載體pPIC9K-lks2構(gòu)建成功(圖1-B)。將該表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得重組菌GS115-pPIC9K-lks2，經(jīng)轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示構(gòu)建成功(圖1-C)。將該重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，取不同誘導(dǎo)時(shí)間的發(fā)酵上清適當(dāng)稀釋，點(diǎn)樣于纖維蛋白平板。結(jié)果顯示，重組畢赤酵母的蚓激酶酶活在84 h達(dá)到峰值254.4 U/mL(圖3)。

圖3 重組菌纖溶活力測(cè)定Fig.3 Fibrinolytic activity of GS115-pPIC9K-lks2

2.3 重組菌GS115-pPIC9K-lks2的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)初始培養(yǎng)條件優(yōu)化

畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)過程中需要消耗大量的氧，當(dāng)菌體濃度較低時(shí)培養(yǎng)基成分和供氧量充足，但隨著菌體量的增加使得培養(yǎng)基中溶氧降低，從而影響菌體代謝，因此接種量對(duì)重組菌產(chǎn)酶影響較大。通過調(diào)整初始OD600值來研究初始菌體量對(duì)重組菌GS115-pPIC9K-lks2的影響，不同接種量的產(chǎn)酶變化趨勢(shì)基本一致，達(dá)到最高酶活時(shí)間點(diǎn)均是誘導(dǎo)84 h。當(dāng)OD600=1.5時(shí)，蚓激酶酶活最高，峰值為288 U/mL(圖4-A)。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化誘導(dǎo)pH值和溫度，結(jié)果如圖4-B,C所示，最佳誘導(dǎo)初始pH值為5.5，最適誘導(dǎo)溫度為28 ℃，此條件下蚓激酶酶活峰值達(dá)364.4 U/mL。

2.3.2 氨基酸添加對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本組成，通過添加氨基酸可在一定程度上加快目的蛋白的合成。本文在BMMY培養(yǎng)基中添加各類氨基酸，研究不同氨基酸對(duì)重組菌的產(chǎn)酶影響。結(jié)果如圖5所示，絲氨酸、甘氨酸和異亮氨酸的添加對(duì)重組菌產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，其中以絲氨酸效果最佳。添加0.1%絲氨酸后，蚓激酶酶活達(dá)到397.6 U/mL。這可能是絲氨酸在菌體代謝過程中影響了重組菌合成蛋白的能力，對(duì)外源基因表達(dá)過程起到一定的調(diào)控作用。

圖4 重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-lks2的發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of fermentation conditions for the GS115-pPIC9K-lks2

2.4 重組菌發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

在搖瓶?jī)?yōu)化基礎(chǔ)上，利用10 L發(fā)酵罐對(duì)重組菌GS115-pPIC9K-lks2進(jìn)行放大培養(yǎng)及高密度發(fā)酵條件研究。種子液濃度為OD600=6時(shí)進(jìn)行上罐發(fā)酵，此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，代謝能力強(qiáng)，有利于擴(kuò)大培養(yǎng)。由于初始菌體量對(duì)畢赤酵母蚓激酶的高效表達(dá)具有重要影響，本文對(duì)發(fā)酵罐初始菌體接種量進(jìn)行了比較研究。結(jié)果如圖6-A所示，初始菌體量的增加有利于提高菌體生長(zhǎng)速率，達(dá)到在相同時(shí)間內(nèi)迅速增加菌體密度的目標(biāo)。隨著菌體密度增加，蚓激酶活力迅速上升，最佳接種菌濃度為9±0.5 g/L(圖6-B)。此外，初始接種量的增加可顯著縮短發(fā)酵周期。當(dāng)菌體初始濃度為9±0.5 g/L時(shí)，誘導(dǎo)前期培養(yǎng)時(shí)間較優(yōu)化前(3±0.5 g/L)縮短了11.5 h，蚓激酶酶活提高了1.08倍(3±0.5 g/L，蚓激酶酶活為527.8 U/mL)，達(dá)到1 098.2 U/mL。

圖5 不同氨基酸對(duì)產(chǎn)酶影響Fig.5 Different amino acid effect on enzyme production

圖6 發(fā)酵罐放大培養(yǎng)Fig.6 Fermentation tank amplification culture

3 討論

蚓激酶屬于絲氨酸蛋白酶，其編碼基因已經(jīng)成功在細(xì)菌、真菌和動(dòng)植物中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。本文研究了蚓激酶在畢赤酵母中的異源表達(dá)，并通過誘導(dǎo)條件優(yōu)化及高密度發(fā)酵研究，有效提高了蚓激酶的產(chǎn)量并縮短了發(fā)酵周期，突破了目前畢赤酵母蚓激酶表達(dá)量低的瓶頸，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

本研究通過對(duì)重組菌GS115-pPIC9K-lks2的誘導(dǎo)條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)初始菌體密度對(duì)產(chǎn)酶效果影響較大。菌體密度過低，會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)環(huán)境中相對(duì)甲醇量偏高，從而產(chǎn)生毒性影響菌體正常代謝。甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母產(chǎn)酶過程需要消耗大量的氧氣，因此菌體密度過高會(huì)導(dǎo)致溶氧不足，造成菌體無法有效利用碳源維持自身生存，同樣影響產(chǎn)酶能力。因而，確定最佳誘導(dǎo)初始菌體密度對(duì)蚓激酶在畢赤酵母中的表達(dá)十分關(guān)鍵。本文在搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)過程中完成了最佳初始菌體量的優(yōu)化，從而顯著提升了蚓激酶的產(chǎn)量，為其大規(guī)模生產(chǎn)提供了方向。