兩株lager啤酒酵母在傳代及自溶過程中生理性能差異的比較

丁華建，段鴻緒，王金晶，李崎，李永仙，鄭飛云，劉春鳳，鈕成拓

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

啤酒酵母作為啤酒釀造的重要原料之一，是影響啤酒品質(zhì)的主要因素，對(duì)啤酒質(zhì)量起決定性的作用[1-2]。在工業(yè)化啤酒釀造過程中，為降低經(jīng)濟(jì)成本，酵母細(xì)胞會(huì)被多次重復(fù)使用，這種操作過程被稱為傳代(serial re-pitching)[1, 3]。在傳代過程中，酵母細(xì)胞在發(fā)酵結(jié)束時(shí)被收集并用于新一代的接種，而酵母細(xì)胞用于連續(xù)發(fā)酵的次數(shù)，叫做“代數(shù)”。啤酒釀造工業(yè)中，活躍的、年輕的和生理穩(wěn)定的酵母細(xì)胞是生產(chǎn)高質(zhì)量啤酒必不可少的，一些啤酒廠也盡量避免出現(xiàn)傳代次數(shù)過多的問題[4]。

啤酒酵母根據(jù)發(fā)酵結(jié)束后酵母細(xì)胞在發(fā)酵液中活動(dòng)的狀態(tài)可分為兩類，分別為上面啤酒酵母和下面啤酒酵母。上面啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)又稱艾爾酵母(ale yeast)，多用于生產(chǎn)艾爾型啤酒，而下面啤酒酵母又稱拉格酵母(lager yeast)，用于發(fā)酵拉格型啤酒。目前世界上大多數(shù)工業(yè)啤酒生產(chǎn)中使用拉格酵母進(jìn)行發(fā)酵，通常所說的啤酒酵母也大多指拉格酵母。早期對(duì)lager酵母的研究認(rèn)為其是由不同酵母菌株包括S.cerevisiae,S.bayanus,S.bayanusvar.uvarum雜交而來[5-6]。 2008年Dunn和Sherlock對(duì)17株lager酵母進(jìn)行基因組分析證明了其雜交本質(zhì)，并指出lager酵母的S.cerevisiae部分的親本很可能是艾爾酵母[7]。而真貝酵母(S.eubayanus)菌株的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步確定了lager酵母是由艾爾酵母S．cerevisiae與S.eubayanus雜交而產(chǎn)生的雜交體[8]。在基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，將拉格酵母分為了2組，分別為第1組Saaz/Carlsberg型酵母(S.carlsbergensis)和第2組Forhberg型酵母(S.pastorianus)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)orhberg型酵母能夠利用麥芽三糖而Saaz型酵母不能利用[9]。雖然拉格酵母與釀酒酵母所表現(xiàn)出來的親緣性很高，但兩者在物質(zhì)代謝尤其是風(fēng)味物質(zhì)代謝調(diào)控上卻有很大的差別，而且與啤酒風(fēng)味代謝相關(guān)的基因基本上都來自于其“非釀酒酵母”(non-cerevisiae)部分的親本[10]。真貝酵母低溫耐受性非常好，因此，來自于真貝酵母的這部分基因賦予了啤酒酵母在低溫條件下良好的發(fā)酵能力。

在啤酒傳代發(fā)酵過程中，酵母細(xì)胞需要應(yīng)對(duì)環(huán)境中的各種壓力，包括滲透壓力、氧化壓力、乙醇?jí)毫Φ?圖1)，當(dāng)酵母細(xì)胞感受到壓力或者對(duì)細(xì)胞來說產(chǎn)生一種毒性刺激而無法抵御時(shí)，細(xì)胞將啟動(dòng)自溶程序[11]。 不同于葡萄酒酵母的自溶會(huì)給葡萄酒帶來面包、黃油等愉悅的香氣[12-13]，啤酒酵母自溶過程中大量的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏到發(fā)酵液中，對(duì)啤酒的風(fēng)味和品質(zhì)造成不利的影響[1-2, 14-15]。通過選育耐壓力脅迫的啤酒酵母能夠一定程度上提高酵母的抗自溶能力[16]，然而并不是非常理想。目前國內(nèi)外少有針對(duì)啤酒酵母在傳代過程中的生理變化進(jìn)行研究，因此深入理解酵母在自溶脅迫過程中的生理變化，不僅有助于了解啤酒酵母?jìng)鞔^程中的抗自溶脅迫機(jī)制，還可以為選育優(yōu)良啤酒酵母提供指導(dǎo)意義。

圖1 發(fā)酵過程中酵母受到的各種壓力變化[17]Fig.1 Various stresses encountered by the yeast during brewing process

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

啤酒酵母Pilsner和5-2均為拉格酵母菌株，主要用于拉格型啤酒的釀造，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。酵母提取物和胰蛋白胨均購自北京OXOID公司；2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)，購于Sigma-Aldrich公司；BacTiter-GloTMMicrobial Cell Viability Assay試劑盒，購于Promega公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(紅色熒光)，購于Beyotime公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和溶液

YPD培養(yǎng)基：20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母抽提物，20 g/L葡萄糖。

檸檬酸鹽緩沖液：10.51 g/L檸檬酸，14.71 g/L三水檸檬酸鈉，用1 mol/L檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0。

亞甲基藍(lán)染色液：美藍(lán)0.3 g，95%乙醇30 mL，0.1 g/L KOH 100 mL，使用時(shí)稀釋10倍。

磷酸鹽緩沖液(PBS)：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，1.44 g/L Na2HPO4，0.74 g/L KH2PO4，用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值在7.2～7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母細(xì)胞的傳代發(fā)酵

從保藏的菌株斜面上取1環(huán)菌接入 10 mL YPD試管中，于 28 ℃下活化36 h，按1%的接菌量加入到70 mL的三角瓶中于 25 ℃培養(yǎng)48 h，最后按照酵母細(xì)胞濃度 2×107CFU/mL接入2 L帶發(fā)酵栓的錐形瓶中，進(jìn)行發(fā)酵。拉格型酵母Pilsner和5-2于11 ℃下發(fā)酵6 d。等發(fā)酵結(jié)束后，收取新鮮的酵母泥，按照相同的接種量進(jìn)行傳代發(fā)酵，直至第5代。

1.2.2 酵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

收集每代發(fā)酵結(jié)束后的新鮮酵母細(xì)胞，用5%戊二醛(0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH=7.2)前固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗1%鋨酸(0.1 mol/L 磷酸緩沖液，pH=7.2)后固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗，乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥后將樣品粘貼在樣品臺(tái)上，離子濺射儀鍍膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)[18]，而超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后置于透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.3 細(xì)胞死亡率和活性檢測(cè)

定時(shí)對(duì)自溶液取樣，適當(dāng)稀釋后與等量亞甲基藍(lán)染液混勻，染色5 min后用血球計(jì)數(shù)板鏡檢計(jì)數(shù)。細(xì)胞呈藍(lán)色的為死細(xì)胞，無色的為活細(xì)胞，記錄細(xì)胞總數(shù)和死細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞活性=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.2.4 抗自溶指數(shù)的檢測(cè)

參考許維娜等[11]研究方案，將2 g主發(fā)酵結(jié)束后的酵母泥加到200 mL檸檬酸鹽緩沖液(模擬自溶液)中，28 ℃靜置培養(yǎng)72 h，每12 h取樣檢測(cè)各指標(biāo)。取1 mL樣品在3 000×g離心5 min，沉淀酵母細(xì)胞用于檢測(cè)死亡率，上清液用于測(cè)定在260 nm和280 nm處的吸光度。根據(jù)2個(gè)吸光值與酵母死亡率的比值判定酵母的抗自溶性能。

1.2.5 基于ATP檢測(cè)細(xì)胞活力

參考BactTiter-GloTMMicrobial Cell Vitality Assay試劑盒說明書，進(jìn)行細(xì)胞ATP的檢測(cè)。細(xì)胞懸浮在100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0，0.1%葡萄糖和1 mmol/L EDTA)中，并使細(xì)胞濃度控制在106CFU/mL左右，取100 μL進(jìn)行檢測(cè)。這個(gè)化學(xué)發(fā)光的光信號(hào)在5 min后就可用TECAN Infinite?200 多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，而且發(fā)光信號(hào)跟ATP的含量成正比。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

參考ANNA LEWINSKA實(shí)驗(yàn)方法[19]，將細(xì)胞懸浮在pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中，并使細(xì)胞濃度控制在107CFU/mL左右。取1 mL樣品，加入 5 μL DCFH-DA于37 ℃避光反應(yīng)30 min，然后用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(測(cè)試條件：λex=488 nm和λem=525 nm)。

1.2.7 DNA的相對(duì)損傷分析

利用TdT介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色來檢測(cè)DNA 的損傷[20-21]。具體的操作是參考細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(紅色熒光)說明書，用4%多聚甲醛固定1 h，溶壁酶在37 ℃處理40 min，最后加TUNEL反應(yīng)混合物在37 ℃黑暗中培養(yǎng)1 h，結(jié)果通過熒光顯微鏡來計(jì)數(shù)，至少有200個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確定DNA損傷。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

2.1.1 細(xì)胞表面形態(tài)分析

對(duì)0代、3代及5代的酵母細(xì)胞進(jìn)行微觀形態(tài)觀察，掃描電鏡結(jié)果如圖2所示，放大倍數(shù)為3 000倍。發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞在0代多呈橢圓形，表面圓潤(rùn)飽滿，有明顯的出芽現(xiàn)象和芽痕，但是在經(jīng)過連續(xù)的傳代發(fā)酵后，酵母細(xì)胞的表面就逐漸出現(xiàn)褶皺變化，甚至由于胞內(nèi)物質(zhì)的流失導(dǎo)致細(xì)胞干癟失形，但是細(xì)胞表面依舊無明顯破損。這說明在連續(xù)傳代發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞壁的破壞是局部的、小規(guī)模的，也反映了細(xì)胞壁在抗壓方面所起到的重要作用。同時(shí)，相對(duì)于菌株5-2，可以清晰地看出菌株P(guān)ilsner在傳代過程中，細(xì)胞形態(tài)變化較大，受損較嚴(yán)重，同時(shí)細(xì)胞表面也出現(xiàn)了干癟失型，這也說明了在傳代發(fā)酵過程中，菌株5-2抗壓能力優(yōu)于菌株P(guān)ilsner。

圖2 不同代數(shù)啤酒酵母的掃描電鏡(SEM)結(jié)果Fig.2 SEM analysis of lager yeasts from different generationsa.b.c分別為Pilsner菌株的0、3、5代的SEM結(jié)果；d.e.f 分別為5-2菌株的0、3、5代的SEM結(jié)果，放大倍數(shù)3 000倍

2.1.2 細(xì)胞壁厚度分析

通過酵母細(xì)胞的切片透射電鏡圖可以清晰地觀察酵母細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)，也可以清楚的觀察到酵母細(xì)胞壁的狀況，利用標(biāo)尺可以測(cè)定不同代數(shù)的酵母細(xì)胞壁厚度。圖3為Pilsner和5-2菌株0、3、5代細(xì)胞的切片透射電鏡圖，放大倍數(shù)為 15 000 倍。每株菌選取 50個(gè)未發(fā)生芽殖的細(xì)胞，測(cè)定不同位置細(xì)胞壁厚度，進(jìn)行平均后得到的酵母壁細(xì)胞壁厚度如表1所示。

圖3 不同代數(shù)啤酒酵母的切片投射電鏡(TEM)結(jié)果Fig.3 TEM analysis of lager yeasts from different generationsa.b.c分別為Pilsner菌株的0、3、5代的TEM結(jié)果；d.e.f 分別為5-2菌株的0、3、5代的TEM結(jié)果，放大倍數(shù)15 000倍

表1 不同代數(shù)啤酒酵母的細(xì)胞壁厚度

單位：nm

根據(jù)圖3所示，可以很明顯看到在經(jīng)過連續(xù)傳代發(fā)酵后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)會(huì)被逐漸水解，這也解釋了為什么細(xì)胞的表面形態(tài)會(huì)在連續(xù)傳代后出現(xiàn)褶皺變化，甚至干癟失形。相對(duì)于菌株5-2，Pilsner細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)水解程度更大，因此才導(dǎo)致其細(xì)胞形態(tài)變化相對(duì)更大。如表1所示，發(fā)現(xiàn)2個(gè)菌株的細(xì)胞壁厚度都在逐漸下降，只是不同菌株的下降趨勢(shì)不同，其中菌株P(guān)ilsner在經(jīng)過5代發(fā)酵后，由開始的233 nm下降到173 nm，厚度減少了25.8%，菌株5-2由開始的212 nm下降到186 nm，厚度只減少了12.3%。酵母細(xì)胞壁是一個(gè)動(dòng)態(tài)的且被調(diào)控地非常有序的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其在保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對(duì)壓力上發(fā)揮著重要作用[22-23]。所以細(xì)胞壁厚度相對(duì)薄的Pilsner菌株在經(jīng)過多次傳代后，細(xì)胞形態(tài)變化較大，胞內(nèi)受損嚴(yán)重，表現(xiàn)出的抗壓能力較5-2弱。

2.2 酵母模擬自溶分析

收集每一代發(fā)酵結(jié)束的酵母泥進(jìn)行模擬自溶分析，結(jié)果如圖4所示。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖4 不同代數(shù)啤酒酵母模擬自溶液中(A260/A280)/死亡率隨時(shí)間的變化情況Fig.4 Changes of (A260/A280) /mortality rate of lager yeastsfrom different generations in citrate buffer

隨著傳代次數(shù)以及自溶時(shí)間的增加，菌株的抗自溶指數(shù)均發(fā)生逐漸下降的趨勢(shì)，不同菌株下降趨勢(shì)不同。在模擬自溶條件下，Pilsner和5-2的抗自溶指數(shù)分別由0代的83和97，下降到3代的40和62，分別下降了51.8%和36.1%，到第5代時(shí)，Pilsner和5-2的抗自溶指數(shù)已經(jīng)達(dá)到21和42，下降了47.5%和32.3%，Pilsner菌株的抗自溶指數(shù)下降趨勢(shì)遠(yuǎn)大于5-2菌株。另外，隨著自溶時(shí)間的延長(zhǎng)，不同代數(shù)的菌株細(xì)胞也是隨著其代數(shù)的增加，抗自溶指數(shù)下降趨勢(shì)變化越加緩慢。由于菌株在傳代過程中會(huì)逐漸衰老，越加難以抵抗一些惡劣的環(huán)境影響，因此可能導(dǎo)致其細(xì)胞的自溶[14, 24]?？棺匀苤笖?shù)的下降意味著抗自溶能力的下降，從圖中可以很明顯地發(fā)現(xiàn)5-2菌株的抗自溶能力強(qiáng)于Pilsner菌株，所以5-2相對(duì)來說能更好地抵御環(huán)境的影響。

2.3 傳代發(fā)酵及自溶過程中細(xì)胞活性及活力研究

2.3.1 細(xì)胞活性及活力分析

2.3.1.1 細(xì)胞活性分析

檢測(cè)分析2個(gè)菌株在傳代以及自溶過程中的細(xì)胞活性，結(jié)果如圖5所示，Pilsner和5-2的細(xì)胞活性在傳代發(fā)酵過程中緩慢下降，經(jīng)過5代發(fā)酵后細(xì)胞活性從98.9%下降到95.8%和96%，分別下降了3.1%和2.9%。然而，在自溶過程中細(xì)胞活性則下降迅速，下降幅度分別達(dá)到37.9%和65.9%。在饑餓狀態(tài)下細(xì)胞活性的下降主要是靠細(xì)胞自身的抗逆性來維持，所以通過分析上述數(shù)據(jù)可以明顯地發(fā)現(xiàn)，5-2菌株細(xì)胞抗逆性強(qiáng)于Pilsner。另外，結(jié)合細(xì)胞抗自溶研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性高的菌株，其抗自溶能力也較強(qiáng)。因此在啤酒發(fā)酵過程中測(cè)定酵母細(xì)胞的活性對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義[25]。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖5 傳代發(fā)酵及自溶過程中啤酒酵母細(xì)胞活性變化情況Fig.5 Changes of cell viability of lager yeasts from differentgenerations in the process of fermentation and autolysis

2.3.1.2 基于ATP含量的細(xì)胞活力分析

細(xì)胞活力與細(xì)胞內(nèi)ATP含量密切相關(guān)[26]，因此了解ATP含量變化對(duì)細(xì)胞活力有著重要作用。通過熒光素-熒光素酶反應(yīng)檢測(cè)ATP，其發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ATP含量成比例，由于它的靈敏度和執(zhí)行速度，使其成為一個(gè)應(yīng)用廣泛的檢測(cè)細(xì)胞活力的方法，ATP檢測(cè)結(jié)果用相對(duì)光單位(RLU)來表示。如圖6所示，ATP含量在傳代過程以及自溶條件下都出現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)。在傳代過程中，Pilsner和5-2的胞內(nèi)ATP含量由開始的5 400 RLU和7 600 RLU到3代時(shí)下降為2 000 RLU和3 300 RLU，分別下降了63.0%和56.6%，到了第5代，其ATP含量已經(jīng)下降到1 200 RLU和2 300 RLU，與第3代相比又下降了40.0%和30.3%。顯然Pilsner的胞內(nèi)ATP含量下降趨勢(shì)遠(yuǎn)大于5-2，而且初始的ATP水平又遠(yuǎn)低于菌株5-2，說明其細(xì)胞活力弱于5-2。此外，在自溶條件下，發(fā)現(xiàn)2株菌株的ATP含量下降趨勢(shì)都是在0～24 h內(nèi)迅速下滑，24 h后下降趨勢(shì)有所緩和，這跟細(xì)胞的抗自溶指標(biāo)變化趨勢(shì)類似，說明細(xì)胞活力與細(xì)胞抗自溶能力也有一定的相關(guān)性。另外，從細(xì)胞活性來看，Pilsner和5-2在傳代的過程中，從0代到5代其菌株的細(xì)胞活性下降不足5%，但是這2個(gè)菌株的胞內(nèi)ATP水平卻急劇下降到約70%。這表明細(xì)胞活性不足以評(píng)價(jià)啤酒酵母在釀造過程中的生理能力，所以就需要結(jié)合兩者來評(píng)估細(xì)胞的生理狀態(tài)，來反映細(xì)胞的活力。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖6 傳代發(fā)酵及自溶過程中啤酒酵母細(xì)胞ATP含量變化情況Fig.6 Changes of ATP levels of lager yeasts from differentgenerations in the process of fermentation and autolysis

2.3.2 胞內(nèi)ROS積累評(píng)價(jià)

ROS的檢測(cè)結(jié)果用相對(duì)熒光單位(relative fluorescent unit, RFU)表示，所以確保相同細(xì)胞數(shù)量很關(guān)鍵。對(duì)2株菌株傳代以及自溶過程中胞內(nèi)ROS積累進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖7 傳代發(fā)酵及自溶過程中啤酒酵母細(xì)胞內(nèi)ROS變化情況Fig.7 Changes of ROS levels of lager yeasts from differentgenerations in the process of fermentation and autolysis

發(fā)現(xiàn)2株菌株胞內(nèi)ROS的含量在傳代過程中都出現(xiàn)逐漸積累現(xiàn)象。從0代發(fā)酵結(jié)束至5代發(fā)酵結(jié)束，Pilsner和5-2的胞內(nèi)ROS含量分別從520 RFU和320 RFU，積累到1 400 RFU和740 RFU，分別上升了169%和131%。高活力活性的菌株，其產(chǎn)生的ROS含量相對(duì)少，且穩(wěn)定。而本文的結(jié)果跟前人的研究結(jié)果[27]類似，都出現(xiàn)ROS積累現(xiàn)象。近年來研究表明，酵母細(xì)胞的復(fù)制老化伴隨著活性氧在母細(xì)胞中的積累。此外，也有研究表明，線粒體已被確定為ROS產(chǎn)生的主要來源[28-29]。所以線粒體ROS的增加進(jìn)一步導(dǎo)致了整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的ROS的積累。然而，在自溶條件下，菌株都出現(xiàn)了先下降后上升的波動(dòng)。有研究表明，為了防止細(xì)胞氧化損傷，酵母細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，包括酶和非酶防御機(jī)制來消除ROS[30]。這就很好的證明了為什么在自溶條件下，ROS會(huì)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。而在惡劣條件下，細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象，這導(dǎo)致了ROS生成和消除之間的不平衡，最終積累了更多的ROS。另外，Pilsner菌株產(chǎn)生的ROS遠(yuǎn)高于菌株5-2，而過多的ROS則會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的生理功能，所以這也間接表明，5-2細(xì)胞活力比Pilsner更強(qiáng)。

2.3.3 細(xì)胞DNA損傷評(píng)價(jià)

DNA斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)的催化下加熒光探針標(biāo)記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP nick-end labeling)法在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA損傷的方法原理[31]。TUNEL法已被廣泛用來評(píng)估酵母在復(fù)制衰老和時(shí)序衰老過程中DNA的損傷[27, 32]。在連續(xù)傳代的過程中和自溶條件下的DNA損傷情況，結(jié)果如圖8所示。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖8 傳代發(fā)酵及自溶過程中啤酒酵母細(xì)胞DNA損傷變化情況Fig.8 Changes of DNA damage of lager yeasts fromdifferent generations in the process of fermentationand autolysis

細(xì)胞的DNA損傷情況在傳代和自溶過程中都越來越嚴(yán)重，而且很明顯的看到，Pilsner菌株的DNA損傷率在第2代就出現(xiàn)迅速上升，整體都高于5-2，而且DNA的損傷趨勢(shì)與ATP下降趨勢(shì)表現(xiàn)幾乎一致，說明酵母細(xì)胞ATP變化與DNA損傷有直接關(guān)系。另外，在前面的研究中，發(fā)現(xiàn)酵母在發(fā)酵過程中，尤其是自溶過程中，會(huì)伴隨著ROS大量積累，而ROS的積累又進(jìn)一步增加DNA的損傷，因此造成DNA的迅速損傷，如圖9所示。

a.b.c分別為菌株P(guān)ilsner的0、3、5代的DNA損傷熒光結(jié)果，d.e.f 分別為菌株5-2的0、3、5代的DNA損傷熒光結(jié)果，其中紅色細(xì)胞表示DNA受損傷的細(xì)胞圖9 不同代數(shù)啤酒酵母細(xì)胞DNA損傷熒光圖Fig.9 DNA damage fluorescence of lager yeasts fromdifferent generations

3 結(jié)論

在工業(yè)化啤酒釀造過程中，為降低經(jīng)濟(jì)成本，酵母細(xì)胞會(huì)被多次傳代重復(fù)使用，然而在傳代過程中，啤酒酵母需要重復(fù)應(yīng)對(duì)環(huán)境中的氧化壓力、滲透壓力等各種壓力，這些壓力會(huì)引起酵母質(zhì)量的下降。當(dāng)酵母細(xì)胞無法抵御所受壓力時(shí)，細(xì)胞開始自我降解，從而引起酵母的自溶衰亡，而酵母自溶又會(huì)給啤酒的風(fēng)味、品質(zhì)帶來極其不利的影響。

本研究從生理學(xué)角度深度分析了啤酒酵母在傳代過程中細(xì)胞形態(tài)、自溶性能、細(xì)胞活性活力等指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)在傳代培養(yǎng)過程中，原本表面圓潤(rùn)飽滿的酵母細(xì)胞會(huì)在活力下降后出現(xiàn)褶皺，甚至因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重水解而干癟失型。同時(shí)，細(xì)胞壁厚度在傳代過程中也會(huì)逐漸變??；(2)在模擬自溶液中，菌株的抗自溶能力隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸減弱，其中菌株P(guān)ilsner自溶程度和死亡率明顯高于5-2；(3)在傳代發(fā)酵及自溶過程中，2個(gè)菌株的細(xì)胞活性均呈緩慢下降趨勢(shì)，而兩者的細(xì)胞活力則呈現(xiàn)迅速下降趨勢(shì)。在細(xì)胞活性下降5%時(shí)，Pilsner和5-2的胞內(nèi)的ATP水平已經(jīng)急劇下降達(dá)到70%，因此需要結(jié)合兩者來評(píng)估細(xì)胞的生理狀態(tài)，來反映細(xì)胞的活力；(4)高活力的菌株其所表現(xiàn)的抗自溶能力、抗壓能力都很強(qiáng)，而且高活力的菌株所產(chǎn)生的ROS含量相對(duì)少，且穩(wěn)定，基本維持在300～1 000 RFU，DNA損傷速度也會(huì)相對(duì)緩慢。另外，胞內(nèi)ROS的積累也會(huì)增加DNA的損傷。研究啤酒酵母在傳代及自溶過程中的生理性能變化，不僅對(duì)現(xiàn)有生產(chǎn)菌株的優(yōu)劣和傳代能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)選育優(yōu)良啤酒酵母也具有重要指導(dǎo)意義。