枯草芽孢桿菌發(fā)酵芝麻香白酒酒醅制備抗氧化活性肽

姬中偉，陳翔，孔小勇，周新虎，毛健*

1(江南大學,糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫 214122) 2(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800)

酒醅是白酒窖池中發(fā)酵的固體物料，含有多種營養(yǎng)物質(zhì)以及微生物代謝產(chǎn)生的非揮發(fā)性物質(zhì)等，主要包括粗淀粉、粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、氨基酸、維生素和其他微量元素等。

高級醇是3個碳以上的一元醇類物質(zhì)的總稱，具有沸點高、揮發(fā)性強的特點[1]。適量的高級醇一方面可以使酒體醇甜，另一方面，它還可以與酸酯化生成酯類物質(zhì)，使酒體豐滿[2]；但是，若其濃度過高，非但不能表現(xiàn)出呈香、呈味的效果，反而會給酒體帶來諸多不好的風格，如苦、澀、沖辣等。另外，其含量過高也會對人體造成一定的危害，這是因為高級醇若代謝時間較長，會抑制神經(jīng)中樞，容易導致飲酒者深醉，出現(xiàn)“上頭”等不良體驗[3]?？傮w而言，高級醇的含量要控制在適當?shù)姆秶鷥?nèi)，不可過高[4]。

在固態(tài)白酒發(fā)酵過程中，高級醇由發(fā)酵原料或酵母菌體蛋白質(zhì)經(jīng)一系列生化反應(yīng)生成。降低白酒發(fā)酵過程的高級醇有多種方法，其中通過添加蛋白酶增強分解蛋白的能力就是方法之一，有研究報道，在固態(tài)白酒發(fā)酵中，增加蛋白酶量，增加氨基酸含量,可以減少發(fā)酵中雜醇油的生成[5]。

當前，通過固態(tài)發(fā)酵豆粕、核桃粕、菜籽粕等原料來制備活性肽的方法已有報道[6-10]。常用的發(fā)酵菌種有枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌等[11-12]，另外，也有少數(shù)采用乳酸菌及酵母菌發(fā)酵的報道[13]，相關(guān)研究結(jié)果表明，發(fā)酵豆粕中高分子量蛋白質(zhì)含量下降，低分子蛋白質(zhì)含量提高。

白酒酒醅同樣含有較高含量的蛋白質(zhì)，江蘇洋河酒廠的芝麻香型白酒的生產(chǎn)原料中含有較高比例的豆粕，因此蛋白含量更高。本研究考慮利用高產(chǎn)酸性蛋白酶的枯草芽孢桿菌對芝麻香型白酒酒醅進行固態(tài)發(fā)酵，分解蛋白制備小分子肽，為降低產(chǎn)品中的高級醇含量提供一種新的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用濃香型和芝麻香型酒醅由江蘇洋河酒廠提供；枯草芽孢桿菌YH-1003，由本實驗室篩選并保存； DPPH和ABTS試劑購自Sigma公司；其他試劑均為國藥集團分析純試劑。

培養(yǎng)基：(1)種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；(2)固體平板培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨4，酵母粉2.5，瓊脂18，脫脂奶粉12；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉40，豆粕粉30，麩皮30，Na2HPO44，K2HPO40.3。上述培養(yǎng)基在121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Amicon Ultra-15超濾管(3 kDa)，Millipore公司；5804R離心機，德國Eppendorf公司；K9840自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Beta 2-8 LDplus冷凍干燥機，德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅主要成分的測定

參照國家標準測定[14-16]。酒醅水分的測定按國標GB/T 6435—2014所述方法，即稱取酒醅后烘干至恒重，計算酒醅損失質(zhì)量與酒醅質(zhì)量的百分比；酒醅中粗蛋白含量按國標GB 5009.5—2016中所述凱氏定氮法進行檢測，其中換算系數(shù)為6.25；酒醅中粗淀粉含量按國標GB/T 5009.9—2008所述酸水解方法進行檢測，即稱取酒醅，利用石油醚和乙醇清洗后，沸水回流條件下HCl水解2 h，之后在甲基紅指示劑下由HCl溶液進行滴定。取3份樣品作為平行樣品，結(jié)果用平均值表示。

1.3.2 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)

(1)菌種的活化：將保存于甘油管中的枯草芽孢桿菌接種于含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h；之后將錐形瓶中的菌種轉(zhuǎn)接至固體平板中，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，將長出的單菌落挑取并接種于含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h后用于接種。

(2)擴大培養(yǎng)：將活化的枯草芽孢種子培養(yǎng)液以3%接種量接種于含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，用于酒醅固態(tài)發(fā)酵。

1.3.3 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵酒醅的工藝流程

稱取10 g烘干的芝麻香型酒醅加入10 mL蒸餾水，混合后加入250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌15 min，冷卻后接入0.2 mL/g枯草芽孢桿菌菌液(約108CFU/mL)，30 ℃下培養(yǎng)48 h，其中每隔12 h振蕩錐形瓶1次。發(fā)酵結(jié)束后，將酒醅置于平皿中50 ℃烘干至恒重，以干物質(zhì)質(zhì)量加入相同質(zhì)量的蒸餾水，浸濕后在30 ℃下超聲萃取30 min，之后在8 000×g離心10 min，取上清液于0.45 μm濾膜過濾后，利用3 kDa超濾膜進行超濾分離，得到的小分子肽液冷凍干燥保存。

1.3.4 酒醅固態(tài)發(fā)酵條件的單因素試驗

在1.3.3固態(tài)發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，本研究對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、固態(tài)發(fā)酵含水量進行了單因素試驗，其中發(fā)酵溫度選擇27、30、33、36、40 ℃、發(fā)酵時間分別為24、36、48、60、72 h，含水量選擇0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL/g。固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，按1.3.3所述方法對小分子肽分離提取，并檢測在不同條件下得到的肽產(chǎn)品含量(直接測定超濾所得濾液中的肽濃度)。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、料液比和接種量作為考察因素，以肽含量為指標，用Design Expert 8.0.6軟件Box-Benhnken中心組合進行優(yōu)化試驗設(shè)計，試驗因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化中的因素和水平Table 1 Coded values of single factor in responsesurface methodology

1.3.6 酒醅肽含量

取3 mL工藝優(yōu)化后發(fā)酵的肽與3 mL 100 g/L三氯乙酸溶液混合，靜置30 min后在8 000×g離心20 min，1 mL上清液中加入1 mL堿性銅溶液后，再加入4 mL福林酚溶液，經(jīng)55 ℃水浴5 min后，于650 nm波長下檢測吸光值，檢測值代入不同濃度牛血清白蛋白繪制的標準曲線,求得肽濃度[18]。

1.3.7 酒醅肽的分子質(zhì)量分布及氨基酸組成[17]

采用優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵工藝條件，得到酒醅肽溶液，經(jīng)三氯乙酸沉淀離心，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，利用高效液相色譜儀檢測肽的分子質(zhì)量分布，根據(jù)不同分子質(zhì)量肽標品在液相中保留時間的不同，檢測酒醅肽的分子質(zhì)量分布，同時以不同分子質(zhì)量肽的峰面積計算不同肽的含量比例。

氨基酸檢測：將4 mL酒醅肽溶液與4 mL濃HCl混合，水解管中充N2后在120 ℃烘箱中水解24 h，之后用10 mol/L NaOH溶液中和并用蒸餾水定容至50 mL，雙層濾紙過濾后，濾液在10 000×g離心30 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用于高效液相色譜儀檢測氨基酸種類和含量。

色譜條件：色譜柱superdex peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm) 凝膠柱; 流動相為0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=6. 0，含有0.1 mol/L NaCl); 流速為0.7 mL/min; 柱溫25 ℃; 檢測波長214 nm。

1.3.8 酒醅肽的抗氧化活性

(1)DPPH自由基清除率[18]：以去離子水為溶劑將凍干的酒醅肽配制成溶液。取2 mL不同濃度酒醅肽溶液與2 mL DPPH溶液(0.14 mmol/L溶于乙醇)，室溫避光靜置30 min后在517 nm波長檢測吸光值，DPPH自由基清除率按公式(1)計算：

(1)

式中：A0為2 mL去離子水與2 mL DPPH溶液混合后的吸光值；A1為2 mL樣品與2 mL DPPH溶液混合后的吸光值；A2為2 mL樣品與2 mL乙醇混合后的吸光值。

(2)清除ABTS自由基[18]：將ABTS溶液與過硫酸鉀配制為ABTS·+母液，使用前稀釋至波長734 nm下吸光值為0.7左右，將0.15 mL酒醅肽溶液與2.85 mL ABTS·+溶液混合，室溫避光靜置10 min后在波長734 nm下檢測吸光值，ABTS自由基清除率按DPPH公式計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究中檢測分析數(shù)據(jù)均為3個平行樣品，以平均值和方差表示，利用GraphPad Prism 7軟件繪圖。Plackett-Burman試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析優(yōu)化采用Design-Expert 8.0.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅主要成分分析

2種酒醅在含水量和粗淀粉較為接近，而在粗蛋白含量中具有較大差異，其中，由于芝麻香型酒醅含有較高比例的豆粕，其粗蛋白含量約為13.5 g/100 g酒醅，是濃香型酒醅粗蛋白含量的2.5倍(表2)。本研究選擇芝麻香型酒醅作為固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)肽的原料。

表2兩種酒醅的主要成分含量

單位：g/100g

2.2 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵酒醅生產(chǎn)小分子肽的單因素試驗

利用本團隊前期篩選得到的產(chǎn)酸性蛋白酶枯草芽孢桿菌對芝麻香型酒醅進行固態(tài)發(fā)酵，并利用響應(yīng)面方法對固態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

2.2.1 發(fā)酵溫度對酒醅肽含量的影響

發(fā)酵溫度為27 ℃時提取得到的肽含量為4.45 mg/mL，當發(fā)酵溫度升高至30 ℃時肽的含量達到最高為5.83 mg/mL，超過30 ℃后肽含量開始下降，在發(fā)酵溫度達到40 ℃時肽含量僅為1.02 mg/mL(圖1)?？莶菅挎邨U菌屬于細菌的一種，其生長、產(chǎn)酶能力及酶學性質(zhì)受溫度影響大。因此，在較高培養(yǎng)溫度下酒醅肽含量的降低，可能是由于在較高溫度下菌體產(chǎn)酶和所產(chǎn)酸性蛋白酶水解能力的下降，導致酒醅肽含量的降低。

圖1 發(fā)酵溫度對枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)肽的影響Fig.1 Effect of culture temperature on peptides productionin solid state fermentation of BFG by B. subtilis

2.2.2 發(fā)酵時間對酒醅肽含量的影響

發(fā)酵時間由24 h延長至48 h時，酒醅肽含量由2.54 mg/mL增加至7 mg/mL(圖2)。在固態(tài)發(fā)酵48 h后，隨時間的增加肽含量開始下降，72 h時肽含量為4.5 mg/mL。在一定的時間范圍內(nèi)，發(fā)酵時間的延長有利于蛋白酶水解產(chǎn)生肽，這主要是由于發(fā)酵時間的延長提高了發(fā)酵中的菌體量和微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶含量，從而有效水解固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中的蛋白質(zhì)并形成小分子肽[6]。但過多的蛋白酶積累并不利于積累肽，因為蛋白酶的過量存在將導致水解形成的肽再次被水解成為更小的肽或直接水解為氨基酸，因此表現(xiàn)為小分子肽含量的下降。

圖2 發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)肽的影響Fig.2 Effect of culture time on peptides production insolid state fermentation of BFG by B. subtilis

2.2.3 含水量對酒醅肽含量的影響

含水量為0.6 mL/g時酒醅肽含量最低，為2.48 mg/mL，當含水量由0.6 mL/g提高至1.2 mL/g時，肽含量隨之增加，在1.2 mL/g時肽含量達到最高的6.42 mg/mL，之后開始下降(圖3)。

圖3 含水量對枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)肽的影響Fig.3 Effect of moisture on peptides production insolid state fermentation of BFG by B. subtilis

2.3 酒醅固態(tài)發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素優(yōu)化試驗的結(jié)果，按照表3中所述條件進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

得到酒醅肽含量(Y)對發(fā)酵溫度(X1)、發(fā)酵時間(X2)和含水量(X3)之間的多元回歸方程為：

Y=-180.292+9.016X1+1.210X2+41.794X3-0.013X1X2+0.246X1X3-0.083X2X3-0.146X12-0.007X22-19.375X32

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗Box-Behnken設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental andpredicted T-AOC values

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

表4 回歸方程各項方差分析Table 4 Analysis of variance for the response surfacequadratic model

2.3.3 響應(yīng)面試驗的理論值及驗證試驗

利用三維曲面分析了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和含水量三條件之間的交互影響，結(jié)果顯示發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的交互影響最為顯著。通過響應(yīng)面的分析在選定的條件范圍內(nèi)，適當提高三因素的水平可有效提高酒醅肽的得率。通過對多元回歸方程求解，得到酒醅固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)條件為：發(fā)酵溫度29.84 ℃、發(fā)酵時間46.83 h、含水量1.19 mL/g，此條件下酒醅肽含量預(yù)測值為7.24 mg/mL。在驗證試驗中，本研究將發(fā)酵條件調(diào)整為：發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間47 h、含水量1.2 mL/g。在此條件下發(fā)酵并提取得到的酒醅肽含量為7.06 mg/mL，相對誤差約為3.74%，對比未優(yōu)化前對照條件下的5.83 mg/mL，酒醅肽含量提高了1.2倍。因此，本研究利用響應(yīng)面優(yōu)化方法有效提高了酒醅肽的產(chǎn)量。

2.4 酒醅肽的分子質(zhì)量分布與氨基酸組成

酒醅肽在液相中根據(jù)保留時間的不同可以分成7個峰，其中分子質(zhì)量在2 000～1 000 Da和1 000～500 Da的肽占比分別為41.56%和15.05%(表5)。此外還含有少量高于2 000 Da的肽，但在酒醅肽溶液中含量較少，占比約為10%左右。在肽樣品中同樣檢測到分子量較低的樣品(<180 Da)，這部分樣品可能主要是被過量水解而積累的氨基酸。

本研究還對酒醅肽中的氨基酸組成及含量進行了檢測和分析。在檢測到的17種氨基酸中(圖4)，含量最高的是谷氨酸(Glu)，達到1 970 mg/L，其次是含量為1 274 mg/L的天冬氨酸(Asp)，含量在500～800 mg/L范圍內(nèi)的氨基酸包括精氨酸(Arg)為745.6 mg/L、亮氨酸(Leu)為696.2 mg/L和酪氨酸(Tyr)為516.1 mg/L。人體必需8種氨基酸中，苯丙氨酸(Phe)和甲硫氨酸(Met)含量較低，分別為2.88和11.88 mg/L，其余6種氨基酸含量在200～800 mg/L范圍內(nèi)。

圖4 酒醅肽中的氨基酸種類和含量Fig.4 The composition and content of amino acids inpeptides produced from Baijiu Fermenting Grains

2.5 酒醅肽的抗氧化活性

酒醅肽質(zhì)量濃度在0.3 mg/mL以上時對DPPH自由基的清除能力要明顯高于ABTS自由基(圖5)。在考察DPPH自由基清除能力時，當酒醅肽質(zhì)量濃度達到0.4 mg/mL時清除率達到85.5%，之后清除率保持穩(wěn)定直至最高肽質(zhì)量濃度(0.6 mg/mL)；而ABTS具有相似的清除能力趨勢，在0.4 mg/mL時酒醅肽對ABTS自由基清除率為66.2%，之后基本保持穩(wěn)定。

圖5 不同質(zhì)量濃度酒醅肽的DPPH和ABTS自由基清除率Fig.5 DPPH and ABTS radical scavenging activity ofvarious concentrations of BDG peptides

酒醅肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量分布及氨基酸組成密切相關(guān)。豆粕固態(tài)發(fā)酵所得到的分子質(zhì)量在2 kDa以下的小肽具有較高的抗氧化活性[19]。另外，本研究所得到的酒醅肽中酪氨酸、賴氨酸等氨基酸含量較高，這些氨基酸本身就具有較強的抗氧化能力[20]。

3 結(jié)論

本研究通過對固態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化后，肽含量最高可達到7.04 mg/mL，同時酒醅肽分子質(zhì)量較多分布在低于2 000 Da，較低分子質(zhì)量可能是酒醅肽具有良好自由基清除能力的原因，在0.4 mg/mL下對DPPH和ABTS自由基具有良好的清除率，顯示了良好的抗氧化活性。本研究結(jié)果表明，芝麻香型酒醅在固態(tài)發(fā)酵的條件下能夠產(chǎn)生具有抗氧化活性的小分子肽，這為降低酒醅蛋白含量從而調(diào)控產(chǎn)品中的高級醇提供了一種參考的途徑。