橙皮素單葡萄糖苷的酶法生物合成與定向調(diào)控

王幻，王玉濤，陳良，朱思明, *

1(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州,510640) 2(喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什,834000) 3(山東奔月生物科技有限公司，山東 東營,257000)

橙皮苷酶(hesperidinase)是一種由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成的復(fù)合酶，主要源自青霉[1]和黑曲霉[2]。該酶可催化橙皮苷轉(zhuǎn)化為橙皮素單葡萄糖苷(hesperetin-7-O-glucoside，HMG)和橙皮素。HMG即橙皮素-7-O-葡萄糖苷，分子式為 C22H24O11，是由橙皮苷脫掉1分子鼠李糖后的產(chǎn)物，是橙皮苷/橙皮素衍生物，非糖部分都是橙皮素。HMG水溶性是橙皮苷的50倍，其生物利用度比橙皮苷好。而且，HMG開環(huán)加氫后是一種新型低熱值甜味劑，即葡萄糖基橙皮素二氫查耳酮，故HMG是一種新型甜味劑的前體物質(zhì)[3-4]，這種新型甜味劑具有無毒、低能量、安全等特點，可作為蔗糖的取代物，同時它還有較強的抗感冒病毒活性和抗氧化活性。

目前，HMG的制備方法有化學(xué)法[5]和生物轉(zhuǎn)化法[6]?；瘜W(xué)法的制備條件難以控制，且目標(biāo)產(chǎn)物HMG容易進一步水解為橙皮素，從而使得目標(biāo)產(chǎn)物得率較低，且易對環(huán)境造成嚴(yán)重污染；而酶法生物合成的條件溫和，不會引起橙皮苷母核結(jié)構(gòu)的變化。且橙皮苷酶價格便宜，但由于是復(fù)合酶，需考慮如何抑制葡萄糖苷酶活性、發(fā)揮鼠李糖苷酶活性，使反應(yīng)歷程向有利于HMG的方向定向轉(zhuǎn)化；此外，橙皮苷溶解性差，需考慮在酶解體系中進行增溶試驗以提高產(chǎn)物HMG的得率。

本文旨在利用HPLC法測定橙皮苷復(fù)合酶的酶學(xué)性質(zhì)及其催化路線，由于本文的重點是探討HMG的生成，所以就不考慮β-D-葡萄糖苷酶的作用，注重研究橙皮苷酶及α-L-鼠李糖苷酶的性質(zhì)。并以目標(biāo)產(chǎn)物的含量及底物轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，優(yōu)化中間產(chǎn)物HMG的酶解條件，實現(xiàn)橙皮苷向HMG定向轉(zhuǎn)化的調(diào)控，擬解決因橙皮苷水不溶性及復(fù)合酶中β-D-葡萄糖苷酶干擾造成的HMG得率低的問題，為甜味劑前體物質(zhì)HMG的定向酶法轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)，有較好的潛在應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙皮苷酶，自制；橙皮苷粗品，由山東奔月生物技術(shù)有限公司提供；橙皮苷、橙皮素單葡萄糖苷及橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品，購自美國Sigma公司；乙腈，色譜純；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(LC-100)，上海伍豐儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器(SHA-BA)，金壇市宏華儀器廠；離心機(KA-1000)，上海安亭科學(xué)儀器廠；電磁爐(C21-RT2166)，美的生活電器制造有限公司；電子天平(CP224C)，奧豪斯儀器(常州)有限公司；pH計(PHSJ-3F)，上海儀分科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Wondasil C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-甲酸溶液(A：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液；B：乙腈)；梯度洗脫程序(0～1 min，85.0% A；1～5 min，85.0% A→75.0% A；5～15 min，75.0% A→60.0% A；15～25 min，60.0% A→50.0% A；25～30 min，50.0% A→85.0% A)；紫外檢測波長：283 nm；反相柱的柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.2 橙皮苷酶活測定方法

采用HPLC法測酶活[7]：錐形瓶中加一定量橙皮苷溶液，置于60 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min水浴搖床中保溫5 min，后加入一定量酶液，繼續(xù)保溫1 h，取出立即用沸水滅活30 min，冷卻后在4 000 r/min下離心20 min，取上清液測定底物剩余量或產(chǎn)物生成量。橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶酶活的確定以橙皮苷的減少量及HMG的生成量為依據(jù)，而β-D-葡萄糖苷酶的酶活以橙皮素的增加量為依據(jù)。

橙皮苷酶酶活的定義：在60 ℃、pH 4.0的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μg橙皮苷或生成1 μg產(chǎn)物所需的酶量為1個酶活單位。

1.3.3 橙皮苷酶對橙皮苷的酶解路線分析

橙皮苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成，其催化路線有2條：(1)橙皮苷先經(jīng)鼠李糖苷酶分解為鼠李糖和HMG，HMG經(jīng)葡萄糖苷酶分解為橙皮素和葡萄糖；(2)橙皮苷先經(jīng)葡萄糖苷酶分解為橙皮素和蕓香糖，蕓香糖再經(jīng)鼠李糖苷酶分解為鼠李糖和葡萄糖。

為確定該復(fù)合酶的可能催化路線，將質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的橙皮苷與橙皮苷酶液(12.28 U)在檸檬酸緩沖液pH值4.0和溫度60 ℃的條件下反應(yīng)150 min。每15 min取樣1次，HPLC法測定不同時間體系中橙皮苷、HMG及橙皮素含量，根據(jù)3種黃酮類物質(zhì)在酶解體系中含量的變化推斷橙皮苷酶的可能催化路線。

1.3.4 橙皮苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.4.1 橙皮苷酶最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

將橙皮苷與橙皮苷酶液(12.28 U)在20、30、40、50、60、70、80 ℃的溫度下進行酶反應(yīng)，緩沖液pH值為4.0，2 h后用HPLC測定橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶(rhamnosidase)的相對酶活，確定其最適反應(yīng)溫度(相對酶活：設(shè)定最高酶活為100%，其他條件下酶活占最高酶活的百分比)。

將等量橙皮苷酶液(12.28 U)分別在20、30、40、50、60、70、80 ℃的水浴中保溫30、60、90、120、150 min，在酶液中加入橙皮苷溶液，HPLC法測定橙皮苷酶酶活，分析橙皮苷酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.4.2 橙皮苷酶最適反應(yīng)pH值和酸堿穩(wěn)定性

在最適反應(yīng)溫度下，將底物與橙皮苷酶液(12.28 U)于pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0的緩沖液中進行酶解反應(yīng)。酶解體系所用緩沖液為100 mmol/L的HCl-KCl 緩沖液(pH 2.0)、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0、4.0、5.0)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.0、7.0、8.0)和Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)。反應(yīng)2 h后用HPLC測定橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的相對酶活，確定反應(yīng)最適pH值。

將橙皮苷酶用上述不同pH值緩沖液混合后置于4 ℃冰箱中分別放置1、2、3、4和5 h后，在最適pH值及溫度下與橙皮苷反應(yīng)1 h，測定其相對酶活，確定橙皮苷酶的酸堿穩(wěn)定范圍。

1.3.4.3 橙皮苷酶及鼠李糖苷酶反應(yīng)動力學(xué)

取等量的橙皮苷酶液(12.28 U)分別與終質(zhì)量濃度為 20～100 μg/mL的橙皮苷溶液混合，在最適溫度及pH值下反應(yīng)，每10 min取樣1次，測定橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的反應(yīng)初速率。以橙皮苷濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，橙皮苷酶和鼠李糖苷酶的反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，分別繪制橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線，從而計算出米氏常數(shù)Km值和最大反應(yīng)速度Vmax值。

1.3.5 HMG的酶法生物轉(zhuǎn)化的定向調(diào)控

采取單因素試驗研究橙皮苷酶實現(xiàn)HMG的定向轉(zhuǎn)化調(diào)控。以HMG的生成量及橙皮苷的轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，考察酶用量(6.14、12.28、15.35和30.7 U)、增溶劑二甲基甲酰胺(DMF)添加量(0.8%、1.6%、3.2%、6.4%和12.8%)、葡萄糖的添加量(0、3、6、9和12 mg/mL)等因素對HMG得率的影響。

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2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮苷酶酶活測定與酶反應(yīng)路線分析

對比DAVIS法[8]及對硝基苯酚法[9]，HPLC法[7]可準(zhǔn)確地檢測橙皮苷、HMG及橙皮素的含量，分析橙皮苷酶解過程中橙皮苷酶、α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶的酶活。

由酶解體系的液相色譜圖1可得酶解1 h后的橙皮苷、HMG及橙皮素的峰面積，求得體系中橙皮苷、HMG及橙皮素對應(yīng)的質(zhì)量濃度分別為63.15、10.50和1.65 μg/mL。進而計算橙皮苷酶、α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶的酶活分別為12.28、3.5和0.413 U/g。

圖1 酶解后體系的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of enzymatic hydrolysis system

由1.3.3所述酶解反應(yīng)的可能路徑，酶解過程中橙皮苷、HMG及橙皮素含量變化情況如圖2所示。

圖2 酶解體系中3種黃酮類物質(zhì)含量的變化Fig.2 Content variations of hesperidin and its hydrolysatein enzymatic hydrolysis system

隨著酶解時間延長，橙皮苷含量逐漸減少，中間產(chǎn)物HMG在短時間內(nèi)含量顯著增加，在1 h后趨近平緩，而橙皮素含量則呈緩慢增加且含量極少。可推測，橙皮苷先在α-L-鼠李糖苷酶作用下生成HMG，且α-L-鼠李糖苷酶的活性較高；隨著反應(yīng)的進行，中間產(chǎn)物積累的越來越多，使得少量HMG在β-D-葡萄糖苷酶的作用下慢慢酶解生成橙皮素[10]。若以催化路線(2)為主，則反應(yīng)在短時間內(nèi)應(yīng)先生成橙皮素，但與事實不符。故可推測橙皮苷復(fù)合酶是以催化途徑(1)為主。即底物橙皮苷應(yīng)先在α-L-鼠李糖苷酶作用下生成HMG，之后β-D-葡萄糖苷酶再將HMG少量酶解成橙皮素。

2.2 橙皮苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 橙皮苷酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

從圖3可看出，隨著溫度的升高，橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的酶活均在增加。當(dāng)溫度在60 ℃時，2種酶的酶活均達到最大值，即酶促反應(yīng)效果最佳。當(dāng)溫度大于70 ℃時，橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的酶活顯著下降，相對酶活低于50%，可能是高溫使酶變性，導(dǎo)致酶活逐漸喪失[11]。故60 ℃是橙皮苷酶的最適反應(yīng)溫度，且橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的最適反應(yīng)溫度相同，可能原因是α-L-鼠李糖苷酶是橙皮苷酶的限速酶。

圖3 溫度對橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on the activities ofhesperidinase and its α-L-rhamnosidase

從圖4可知，橙皮苷酶在不同溫度下處理一段時間后，隨著處理時間的增加，相對酶活整體呈現(xiàn)下降趨勢。但是在20～70 ℃的溫度范圍內(nèi)，處理時間為150 min時，橙皮苷的相對酶活仍維持在60%以上；且當(dāng)溫度為60 ℃時，其相對酶活近乎100%；當(dāng)溫度為20 ℃或70 ℃時，橙皮苷酶的相對酶活有所下降；而當(dāng)溫度為80 ℃時，橙皮苷酶活的耐熱性急劇下降，相對酶活迅速降低。

圖4 橙皮苷酶酶活的熱穩(wěn)定性Fig.4 Effect of temperature on the thermo-stabilityof the hesperidinase

2.2.2 橙皮苷酶的最適反應(yīng)pH值和酸堿穩(wěn)定性

圖5 pH值對橙皮苷酶活和α-L-鼠李糖苷酶活的影響Fig.5 Effect of pH on the activities of hesperidinase andits α-L-rhamnosidase

橙皮苷酶在不同pH條件下處理5 h后的酶活如圖6所示，在pH 3.0～7.0的范圍內(nèi)處理5 h后橙皮苷的相對酶活仍保留60%以上；在pH 4.0時，橙皮苷酶酶活基本無變化；在pH 5.0～6.0時，橙皮苷酶相對酶活均保持在80%以上。當(dāng)pH<3.0或>7.0時，橙皮苷酶的酶活在短時間內(nèi)急劇下降，其最終相對酶活為20%左右。故橙皮苷酶在pH 3.0～7.0的環(huán)境下穩(wěn)定性較好，即橙皮苷酶是嗜酸性酶。

圖6 橙皮苷酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.6 Effect of pH on stability of the hesperidinase

2.2.3 橙皮苷酶和鼠李糖苷酶的酶反應(yīng)動力學(xué)

一般酶解反應(yīng)過程中底物的減少量與產(chǎn)物的生成量在一段時間內(nèi)是呈線性變化的，其線性變化的斜率即為酶解反應(yīng)初速度。以橙皮苷濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以橙皮苷酶或鼠李糖苷酶反應(yīng)的初速度倒數(shù)為縱坐標(biāo)，作2種酶的雙倒數(shù)曲線，結(jié)果如圖7所示。橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的雙倒數(shù)曲線分別為y=340.13x+1.146 4和y=584.49x+2.513 1。計算可得橙皮苷酶的Km值為296.69 μg/mL，Vm值為0.872 3 μg/(mL·min)；α-L-鼠李糖苷酶的Km值為232.58 μg/mL，Vm值為0.397 9 μg/(mL·min)。

圖7 橙皮苷酶及α-L-鼠李糖苷酶的雙倒數(shù)曲線Fig.7 Double reciprocal curves of hesperidase andα-L-rhamnosidase

2.3 HMG定向生物轉(zhuǎn)化的過程調(diào)控

2.3.1 酶用量對HMG定向轉(zhuǎn)化過程的影響

酶添加量與底物濃度的比例對酶解過程有著重要影響。在最適反應(yīng)溫度60 ℃和pH 4.0下，其他條件均保持一致，改變酶用量，反應(yīng)5 h。前3 h每隔30 min取樣1次，后2 h每隔1 h取樣1次，測定酶解液中的目標(biāo)產(chǎn)物HMG的含量及反應(yīng)底物橙皮苷的轉(zhuǎn)化率隨時間的變化，結(jié)果如圖8所示。

A-HMG含量的變化曲線；B-橙皮苷轉(zhuǎn)化率變化曲線圖8 酶用量對橙皮苷酶解過程的影響Fig.8 Effect of enzyme dosage on the hydrolysis of hesperidin

由圖8可知，隨著酶用量的增加，中間產(chǎn)物HMG的含量和底物橙皮苷的轉(zhuǎn)化率也隨之增加，且HMG含量達到最大值所需時間有所縮短?？赡茉蚴?，在酶解體系中，隨著酶量的增加，體系中橙皮苷酶在一定時間和空間內(nèi)與底物接觸機會增加，即橙皮苷酶催化底物橙皮苷轉(zhuǎn)化的速率變快，故HMG含量達到最大值的時間縮短。對比圖8-A和圖8-B發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)的進行，橙皮苷的轉(zhuǎn)化率一直呈上升趨勢，而HMG含量卻逐漸平穩(wěn)，這是因為隨著HMG含量的積累，雖然有一部分橙皮苷轉(zhuǎn)化成HMG，但同時HMG又少量酶解成橙皮素[13]。從圖中還可看出，當(dāng)酶用量大于15.35 U時，橙皮苷的轉(zhuǎn)化率增加甚微，且反應(yīng)至120 min時，中間產(chǎn)物HMG含量達最大值，得率為18.6%。故從節(jié)約成本的角度考慮，最適反應(yīng)酶用量為15.35 U。

2.3.2 增溶劑二甲基甲酰胺(DMF)添加量對HMG酶法合成的影響

酶解過程往往是在緩沖溶液體系中進行，由于底物橙皮苷是幾乎不溶于水，會影響酶促反應(yīng)的效率。故考慮在酶解體系中加入增溶劑以促進底物橙皮苷的溶解，使酶解反應(yīng)順利進行。橙皮苷在常溫下極易溶于DMF溶液，故采用DMF作為底物增溶劑。在酶解溫度為60 ℃、pH值4.0、酶用量為15.35 U的條件下，考察增溶劑添加量對目標(biāo)產(chǎn)物得率的影響。酶反應(yīng)5 h，定時取樣測定酶解液中HMG的含量及橙皮苷的轉(zhuǎn)化率隨時間的變化，結(jié)果如圖9所示。

A-HMG生成量的變化曲線；B-橙皮苷轉(zhuǎn)化率變化曲線圖9 DMF添加量對橙皮苷酶解過程的影響Fig.9 Effect of DMF addition on the hydrolysis of hesperidin

由圖9可知，隨著酶解體系中DMF含量的增加，酶解過程的中間產(chǎn)物HMG的含量和底物橙皮苷的轉(zhuǎn)化率均隨之減少，且隨著時間的延長，HMG含量逐漸平穩(wěn)。這是因為在酶解體系中，隨著DMF含量的增加，雖然體系中橙皮苷的溶解度會變大，但DMF同時會抑制橙皮苷酶的酶活[14]，導(dǎo)致橙皮苷的轉(zhuǎn)化率隨著DMF含量的增加而減小，影響HMG的生成，且反應(yīng)時間為3 h時，得到的中間產(chǎn)物HMG的量基本穩(wěn)定，得率為20.0%。故為得到更多的HMG，選擇增溶劑DMF的添加量越少越好，只需保證其添加量能使橙皮苷較好的溶解即可，本實驗選擇最適DMF的添加量為0.8%。

2.3.3 葡萄糖添加量對HMG制備的影響

橙皮苷酶催化路線主要為(1)，可見中間體HMG的生成與β-D-葡萄糖苷酶也有關(guān)。β-D-葡萄糖苷酶會將得到的HMG繼續(xù)酶解為橙皮素，為提高目標(biāo)產(chǎn)物HMG含量，考慮在酶解體系中加入一定量的葡萄糖以抑制橙皮苷復(fù)合酶中的β-D-葡萄糖苷酶對中間產(chǎn)物的過度酶解[15]。在60 ℃、pH為4.0、酶用量為15.35 U、增溶劑DMF添加量0.8%的酶反應(yīng)條件下，添加不同量的葡萄糖溶液(圖10)，反應(yīng)5 h，每隔1 h取樣1次，測定酶解液中的HMG的含量及反應(yīng)底物橙皮苷的轉(zhuǎn)化率隨時間的變化，結(jié)果如圖10所示。

A-HMG生成量的變化曲線；B-橙皮苷轉(zhuǎn)化率變化曲線圖10 葡萄糖添加量對橙皮苷酶解過程的影響Fig.10 Effect of glucose addition on the hydrolysis ofhesperidin

由圖10可知，未加葡萄糖組的中間產(chǎn)物HMG的含量最少，而此時橙皮苷的轉(zhuǎn)化率卻是最大。原因可能是葡萄糖一方面抑制了β-D-葡萄糖苷酶的酶活使得中間產(chǎn)物HMG沒有向橙皮素方向轉(zhuǎn)化，另一方面葡萄糖的存在引起了產(chǎn)物抑制作用，使得橙皮苷的轉(zhuǎn)化率下降。酶解體系中隨著葡萄糖濃度的增加，酶解過程的中間產(chǎn)物HMG的含量和底物橙皮苷的轉(zhuǎn)化率均隨之減少。這是因為隨著葡萄糖濃度的增加，雖然抑制了體系中得到的HMG進一步酶解為橙皮素，但β-D-葡萄糖苷酶的酶活本身較小，過量的葡萄糖添加量反倒會抑制橙皮苷的酶促反應(yīng)方向，從而使得中間產(chǎn)物HMG的得率下降。反應(yīng)3 h時，HMG含量基本穩(wěn)定，最終HMG得率為35.8%，相較于直接反應(yīng)未加適量增溶劑和葡萄糖苷酶抑制劑條件下得率提高約2倍，且在單位酶活下等量酶液反應(yīng)所產(chǎn)生的目標(biāo)產(chǎn)物HMG得率較前人報道的提高了4.7倍[16]，實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的定向調(diào)控效果。為既能抑制HMG的過度酶解，又能盡量減少對橙皮苷酶的酶活影響，本實驗選擇最適葡萄糖濃度為3 mg/mL。

3 結(jié)論

經(jīng)HPLC法測得的橙皮苷酶、α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶的酶活分別為12.28、3.5和0.413 U/g；酶反應(yīng)最適溫度為60 ℃，最適pH值4.0，此時橙皮苷酶及α-L-鼠李糖苷酶的動力學(xué)常數(shù)Km值分別為296.69 μg/mL和232.58 μg/mL，Vm值分別為0.872 3 μg/(mL·min)和0.397 9 μg/(mL·min)；橙皮苷酶的熱穩(wěn)定性較好，是一種嗜酸性酶，在酸性條件下穩(wěn)定性較高；考慮添加3 mg/mL葡萄糖抑制β-D-葡萄糖苷酶活性，增溶劑DMF添加量為0.8%，可實現(xiàn)橙皮苷向HMG而不是橙皮素的酶法轉(zhuǎn)化的定向調(diào)控；在溫度60 ℃、pH 4.0、酶用量15.35 U、DMF添加量0.8%和葡萄糖添加量3 mg/ml條件下反應(yīng)3h，HMG最終得率可達35.8%。研究可為高倍查爾酮類甜味劑中間體開發(fā)提供參考，具有潛在應(yīng)用價值。