芳香族化合物前體物質(zhì)酪氨酸和苯丙氨酸在白酒中的來源解析

聶元皓，徐巖，吳群*，杜海*

1( 江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與酶技術(shù)中心，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇 宿遷，223814)

芳香族化合物是指分子中含有至少一個(gè)苯環(huán)的有機(jī)化合物[1]，含量僅占白酒中風(fēng)味組分總量的0.09%～0.18%[2]，但卻具有閾值低、香味強(qiáng)度大、香味保留時(shí)間長的特點(diǎn)[3]，對(duì)成品白酒的質(zhì)量具有很大影響[4-5]。如苯乙酸乙酯的閾值為650 μg/L，具有令人愉悅的蜂蜜香[6]；苯乙醛的閾值為4 μg/L，具有玫瑰花香[7]，這些成分對(duì)白酒口感的提升具有重要的作用。而間甲酚具有皮革味[8]，對(duì)甲酚具有動(dòng)物臭味[7]，對(duì)酒體風(fēng)味造成負(fù)面影響。

白酒中的芳香族化合物的來源之一就是原料中芳香族氨基酸的降解[9]，涉及的途徑包括以下幾條：(1)在芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下，酪氨酸(tyrosine, Tyr)和苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)分別降解為對(duì)羥基苯丙酮酸和苯丙酮酸，隨后經(jīng)過氧化脫羧反應(yīng)生成對(duì)羥基苯乙酸和苯乙酸，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為苯乙醇、苯乙醛、苯乙酸乙酯等產(chǎn)物[10]；(2)在酪氨酸解氨酶和苯丙氨酸解氨酶的作用下生成對(duì)香豆酸，隨后轉(zhuǎn)化為多種次級(jí)代謝產(chǎn)物[11]；(3)在脫羧酶作用下直接脫羧生成相應(yīng)的胺化合物。

Tyr和Phe作為白酒中芳香族化合物的關(guān)鍵前體物質(zhì)，不僅直接影響食品的口感，還會(huì)影響一系列風(fēng)味物質(zhì)的形成[12-13]，有必要對(duì)其含量進(jìn)行合理的控制。目前，對(duì)于白酒中芳香族化合物的研究主要集中在化合物自身的定性和定量方面，對(duì)于其前體物質(zhì)Tyr和Phe在白酒釀造過程中的主要生成階段還不清楚，不同菌株、不同原料對(duì)發(fā)酵過程中Tyr和Phe含量的影響也尚未可知。

本研究通過定量檢測原料中的氨基酸含量以及發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化趨勢(shì)，明確了芳香族化合物前體氨基酸的主要生成階段，并驗(yàn)證了菌株和原料對(duì)于酒醅中氨基酸組成的影響，這對(duì)于白酒質(zhì)量品質(zhì)的提升和白酒釀造的科學(xué)化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌株

所用菌株皆由本研究室自主篩選鑒定。所有菌株保藏于-80 ℃，使用前于相應(yīng)培養(yǎng)基活化。

1.1.2 發(fā)酵樣品采集

原料、糖化料、酒醅等樣品取自安徽某白酒廠，對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行跟蹤取樣。所有樣品于-20 ℃保存。

1.1.3 試劑

酵母膏、蛋白胨購自O(shè)xoid公司；其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑(北京)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 10；

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20；

PDA培養(yǎng)基：稱取37 g成品PDA培養(yǎng)基，加入1 000 mL蒸餾水，121 ℃滅菌20 min。

脫脂乳培養(yǎng)基(g/L)：脫脂乳10，蛋白胨5，酵母膏2.5，淀粉10，KH2PO 0.3，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1，115 ℃滅菌30 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：高粱、玉米、大米、糯米、小麥等原料用溫水浸泡(玉米40～60 ℃浸泡4 h，高粱70～80 ℃浸泡18 h，糯米、大米、小麥70～80 ℃浸泡2 h)；瀝干后調(diào)整含水量至大約50%，每瓶45 g分裝到250 mL三角瓶，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器和設(shè)備

安捷倫液相色譜儀1100,美國Agilent公司；ODS HYPERSIL色譜柱,美國Thermo Fisher Scientific公司；Milli-Q超純水系統(tǒng),美國Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料和發(fā)酵過程中氨基酸含量的測定

樣品的預(yù)處理：精確稱取5 g樣品(顆粒狀原料需預(yù)先粉碎至粉狀)至25 mL容量瓶，記錄重量，用50 g/L的三氯乙酸溶液定容。靜置1 h后過雙層濾紙，隨后取1 mL上清，12 000 r/min離心10 min。取400 μL上清加入液相小瓶，待測。

氨基酸含量的測定：參考張莊英等[14]的方法，采用柱前衍生化高效液相色譜紫外檢測器測定氨基酸含量。

1.3.2 微生物對(duì)蛋白質(zhì)水解能力的比較

采用水解圈法進(jìn)行測定。將菌株從甘油管劃線活化后，用接種環(huán)挑取單菌落或菌絲點(diǎn)于脫脂乳培養(yǎng)基上，細(xì)菌于30 ℃培養(yǎng)24 h，酵母和霉菌37℃培養(yǎng)72 h，隨后測量水解圈直徑D和菌落直徑d，并計(jì)算水解圈直徑與菌落直徑的比值D/d。

1.3.3 菌株和原料因素對(duì)氨基酸含量的影響

菌株活化后調(diào)整細(xì)菌數(shù)/霉菌孢子數(shù)至107～108個(gè)/mL并接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，接菌量5 mL； 30 ℃培養(yǎng)7 d，期間每隔12 h搖瓶1次。對(duì)照組接種等量生理鹽水，其余操作均與實(shí)驗(yàn)組相同，以消除發(fā)酵起始時(shí)不同培養(yǎng)基中的氨基酸含量差異及發(fā)酵過程中原料的自發(fā)水解作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。所有處理設(shè)置3個(gè)平行。發(fā)酵結(jié)束后按1.3.1測定氨基酸含量，將接種微生物的培養(yǎng)基中氨基酸含量減去空白對(duì)照中氨基酸含量，即為接種處理后氨基酸含量的凈增長量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中Tyr和Phe的主要生成階段

2.1.1 不同原料中的Tyr和Phe含量

原料是白酒釀造過程中微生物生長繁殖的根本營養(yǎng)來源，不同釀酒原料中的營養(yǎng)物質(zhì)含量和比例也各不相同[15-16]。測定5種常見釀酒原料自身帶入發(fā)酵過程中的Tyr和Phe含量，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，小麥和玉米分別貢獻(xiàn)較多的Tyr和Phe，而高粱、大米和糯米帶入發(fā)酵過程中的初始Tyr和Phe含量不足20 mg/kg。較糖化和發(fā)酵階段的氨基酸含量而言(圖2，圖3)，原料帶入的初始Tyr和Phe含量僅占發(fā)酵過程中Tyr和Phe含量的10%左右，表明大部分Tyr和Phe是在后續(xù)發(fā)酵過程中經(jīng)微生物的水解作用生成的。

圖1 不同原料中的Tyr和Phe含量Fig.1 Tyrosine and phenylalanine contents in differentraw materials

2.1.2 糖化過程中Tyr和Phe含量的變化

糖化過程是谷物原料中的淀粉等大分子物質(zhì)在微生物作用下逐步水解為糖、氨基酸等小分子物質(zhì)的過程，對(duì)于微生物生長必須營養(yǎng)物質(zhì)的積累具有重要作用。由圖2可知，糖化初始時(shí)的Tyr和Phe含量僅為20 mg/kg左右，經(jīng)過45.5 h的微生物作用后Tyr和Phe含量分別增長了4倍和2.5倍，達(dá)到105 mg/kg和73 mg/kg，表明糖化過程中存在大量的植物蛋白被水解為氨基酸。

圖2 糖化過程中Tyr和Phe含量的變化Fig.2 Changes of tyrosine and phenylalanine contentsin the process of saccharification

2.1.3 酒醅中Tyr和Phe含量的變化

正糟酒醅和雙輪底酒醅中的Tyr和Phe含量具有相似的變化規(guī)律。對(duì)Tyr而言，其含量在0～25 d內(nèi)由約200 mg/kg平穩(wěn)增長至約500 mg/kg，25 d后則呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。而Phe的含量在0～3 d迅速下降，隨后呈現(xiàn)與Tyr相似的變化趨勢(shì)。Tyr和Phe在發(fā)酵過程中的含量變化是白酒微生物消耗和生成2種氨基酸的綜合反映。由圖3可知，在發(fā)酵前期，酒醅中氧氣含量充足，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，且酒醅中含有細(xì)菌、霉菌等大量具有蛋白質(zhì)水解能力的微生物[17]，谷物蛋白被水解生成Tyr和Phe的速率大于菌體對(duì)2種氨基酸的消耗速率，從而導(dǎo)致2種氨基酸含量的迅速升高。而在發(fā)酵后期，氧氣逐漸耗盡，好氧微生物減少，厭氧微生物逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，但厭氧微生物對(duì)蛋白質(zhì)的水解能力差，使得相應(yīng)氨基酸含量因菌體消耗而逐漸下降。結(jié)合圖2可知，發(fā)酵起始與糖化結(jié)束時(shí)的氨基酸含量具有很大差異，這是由于混料時(shí)大曲帶入了大量的氨基酸。而Phe含量在發(fā)酵初期迅速下降則可能是由Tyr和Phe代謝途徑的差異引起微生物對(duì)2種氨基酸具有不同的的生成和消耗速率所造成的。

A-正糟酒醅中Tyr和Phe含量的變化；B-雙輪底酒醅中Tyr和Phe含量的變化圖3 發(fā)酵過程酒醅中Tyr和Phe含量的變化Fig.3 Changes of tyrosine and phenylalanine contents infermentation process

綜上所述，在原料糖化的48 h內(nèi)，Tyr和Phe含量由約20 mg/kg分別增長至105 mg/kg和73 mg/kg，在入池發(fā)酵的0～25 d內(nèi)正糟酒醅中的Tyr含量由225 mg/kg增長至497 mg/kg，Phe含量在6～25 d內(nèi)由480 mg/kg增長至約805 mg/kg，雙輪底酒醅中Tyr和Phe在相應(yīng)時(shí)期也實(shí)現(xiàn)了不同程度的增長。這表明糖化階段和入池發(fā)酵的前期階段是白酒釀造過程中Tyr和Phe的主要生成階段。

2.2 菌株和原料因素對(duì)氨基酸含量的影響

2.2.1 白酒微生物對(duì)蛋白質(zhì)水解能力的初步比較

由于體內(nèi)酶系的不同和營養(yǎng)需求的差異，不同微生物之間對(duì)蛋白質(zhì)的水解能力具有很大的差別。當(dāng)能夠水解蛋白質(zhì)的微生物在脫脂乳培養(yǎng)基上生長時(shí)，菌株所產(chǎn)的蛋白酶能夠水解培養(yǎng)基中的脫脂乳粉蛋白，使原本不透明的脫脂乳培養(yǎng)基變得透明，從而產(chǎn)生透明圈。D/d值反映了菌體對(duì)蛋白質(zhì)水解能力的大小，表1顯示了白酒釀造體系中常見的不同種屬的微生物在脫脂乳培養(yǎng)基上的生長狀況。

表1 微生物對(duì)蛋白質(zhì)水解能力比較Table 1 Comparison of microbial proteolysis ability

注：ND表示未檢測到菌落直徑或水解圈直徑。

結(jié)果表明，20株微生物中地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)對(duì)蛋白質(zhì)的水解能力最強(qiáng)，D/d值在1.8～2.0之間，其次是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，D/d值為1.7。而乳糖短桿菌(Brevibacteriumlactosus)、黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、異常畢赤酵母(Pichiaanomala)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)不具備水解蛋白質(zhì)的能力。紫紅曲霉(Monascuspurpureus)、華根霉(Rhizopuschinensis)等霉菌的D/d值在0.9～1.5之間，略低于細(xì)菌；而酵母中僅膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)和拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)具有蛋白水解能力。這一結(jié)果表明，白酒微生物中能夠水解蛋白質(zhì)的多數(shù)為細(xì)菌，其次為霉菌，而大部分酵母基本不具備對(duì)蛋白質(zhì)的水解能力。

2.2.2 不同菌株和原料對(duì)氨基酸含量的影響

不同微生物之間自身酶系的差異和在不同原料上生長狀況的差異，共同決定了不同微生物和原料對(duì)于氨基酸含量具有不同的影響?？刂漆勗爝^程中特定氨基酸的含量，關(guān)鍵是控制微生物對(duì)原料的水解作用。由2.2.1，挑取對(duì)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)水解能力的Baclicuslincheniformis81、Bacillussubtilis80、BacillussubtilisJQ11、BacillusamyloliquefaciensJQ8、PichiamembranifaciensC-9和AspergilluskawachiiAKF2作為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，通過比較接菌發(fā)酵過程前后培養(yǎng)基中氨基酸含量的變化探究菌株和原料因素對(duì)不同氨基酸含量的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 菌株和原料因素對(duì)氨基酸含量的影響Table 2 Effect of strains and raw materials on amino acid contents

注：JQ11-Bacillussubtilis; JQ8-Bacillusamyloliquefaciens; 80-Bacillussubtilis; 81-Baclicuslincheniformis; C-9-Pichiamembranifaciens; AKF2-Aspergilluskawachii。

發(fā)酵過程中氨基酸的凈增長量取決于微生物對(duì)氨基酸消耗作用和對(duì)蛋白質(zhì)水解作用的相對(duì)強(qiáng)弱，當(dāng)菌體對(duì)氨基酸的消耗速率大于菌株水解蛋白質(zhì)生成氨基酸的速率時(shí)就表現(xiàn)為氨基酸含量的負(fù)增長。從氨基酸總量的變化來看，無論是同一原料接種不同微生物，還是同一微生物接種不同原料，發(fā)酵前后培養(yǎng)基中氨基酸含量的變化皆具有很大差異，這表明微生物和原料對(duì)氨基酸含量具有很大影響。總體而言，5種原料的可水解性從易到難依次為：糯米、大米、高粱、小麥和玉米，6種微生物對(duì)蛋白質(zhì)的水解能力從大到小依次為JQ11、AKF2、JQ8、80、81和C-9。JQ11具有很強(qiáng)的蛋白酶活性，水解原料極易產(chǎn)生氨基酸的積累，提高該類菌的接入比例可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過程中氨基酸的含量上升。這與2.2.1的結(jié)果一致表明，細(xì)菌和霉菌在谷物蛋白降解為氨基酸的過程中發(fā)揮著主要作用，而酵母對(duì)谷物蛋白的降解能力相對(duì)較弱。

從Tyr和Phe含量來看，以糯米原料為底物時(shí)培養(yǎng)基中Tyr和Phe含量的增長要高于其他原料，混料時(shí)提高糯米所占部分的比重可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過程中Tyr和Phe含量的增加。同一菌株接種不同原料發(fā)酵后培養(yǎng)基中Tyr和Phe含量的變化具有很大差異，表明不同釀造原料之間的可水解特性不同，這與不同谷物顆粒之間結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)成分的差異有關(guān)[15-16]。JQ11發(fā)酵5種原料普遍產(chǎn)生較高含量的Tyr和Phe。80和JQ11雖然同屬于Bacillussubtilis，但二者以同一種原料為底物進(jìn)行發(fā)酵后培養(yǎng)基中氨基酸總量、Tyr含量和Phe含量的變化皆有很大差異，這表明即使同一種屬的微生物對(duì)谷物蛋白的水解特性也可能大不相同。

3 結(jié)論

利用高效液相色譜測定原料、糖化料和不同發(fā)酵階段酒醅中的氨基酸含量結(jié)果表明，原料自身帶入的Tyr和Phe含量僅為發(fā)酵過程中Tyr和Phe含量的10%左右，大部分的Tyr和Phe生成于谷物原料的糖化過程和酒醅入池發(fā)酵的前期。

固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步表明，原料差異對(duì)發(fā)酵過程中的氨基酸總量和Tyr與Phe含量的變化均有影響。以糯米為底物進(jìn)行發(fā)酵最容易生成大量的氨基酸，這說明在5種原料中糯米更易于被微生物所水解。此外，以糯米原料為底物進(jìn)行發(fā)酵時(shí)Tyr和Phe含量的增長也要高于其他原料，從而更有利于芳香族化合物的生成。比較不同微生物對(duì)發(fā)酵原料的水解結(jié)果可知，JQ11對(duì)蛋白質(zhì)的水解能力遠(yuǎn)大于其他菌株，白酒釀造體系中水解原料產(chǎn)生Tyr 和Phe的主導(dǎo)微生物。同一種屬的微生物以同一原料為底物進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后氨基酸總量和Tyr與Phe含量的變化情況具有很大差異，這說明即使是同種屬的微生物，不同菌株之間對(duì)蛋白質(zhì)的水解特性也可能不同。不同菌株之間對(duì)蛋白質(zhì)水解特性差異的原因還有待進(jìn)一步探究。