蠟塊表面脫鈣法在骨肉瘤標(biāo)本制片中的應(yīng)用

吳 平，任彩虹， 陳祥娜， 宋芳玲， 陳余朋，張 聲

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科, 福建 福州 350005)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)(immunohistochemistry, IHC)對(duì)于骨肉瘤疾病鑒別診斷、判斷臨床預(yù)后具有重要意義，適體靶向治療骨肉瘤，需要利用熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)分析MDM2基因擴(kuò)增情況。但是骨肉瘤組織質(zhì)地較硬，需要使用脫鈣液脫去鈣質(zhì)后才能制作完整的石蠟切片，以利于IHC檢測(cè)及FISH檢測(cè)。常用的脫鈣液及脫鈣方法易造成組織細(xì)胞表面抗原破壞或丟失，影響IHC結(jié)果[1]。而且難以保持核酸的完整性，影響其與FISH探針的結(jié)合[2]。因此，尋找一種新的脫鈣方法，能夠保護(hù)抗原及核酸的完整性是目前骨肉瘤領(lǐng)域迫切需要解決的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源： 收集2017年9月至2018年3月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科骨肉瘤標(biāo)本17例，按照《臨床技術(shù)操作規(guī)范.病理學(xué)分冊(cè)》的要求，使用硬組織切割機(jī)將每例骨組織切取1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm大小的組織塊2塊置于包埋盒中，分別放入10%中性緩沖甲醛固定液中12 h后，自來(lái)水沖洗5 min。標(biāo)本來(lái)源的患者均同意實(shí)驗(yàn)措施，并簽署知情同意書(shū)。該研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑和試劑盒：脫鈣液(廣州維格斯公司);兔抗人ki-67、stab-2和 survivin抗體(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);鼠抗人caspase9、兔抗人Bax和二抗EnVision試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司);骨肉瘤MDM2基因檢測(cè)試劑盒(FISH法)(Abbott公司)。

1.2 方法

1.2.1 表面脫鈣法(surface decalcification,SD)：標(biāo)本取材后不經(jīng)脫鈣液脫鈣，脫水包埋成蠟塊，經(jīng)切片機(jī)粗修暴露整個(gè)組織切面后，置于脫鈣液中脫鈣1 h，75%乙醇浸泡去酸30 min，切片備用。

1.2.2 常規(guī)脫鈣法: (routine decalcification, RD): 標(biāo)本取材后置于脫鈣液中脫鈣，每間隔1 h觀察，以大頭針能輕松刺入為脫鈣完成。標(biāo)本脫鈣處理后放入75%乙醇溶液中浸泡去酸30 min，然后脫水包埋成蠟塊，切片備用。

1.2.3 HE染色:切片行HE染色, 按照整體形態(tài)、整體染色、細(xì)胞輪廓、細(xì)胞質(zhì)染色細(xì)節(jié)、核染色細(xì)節(jié)等5個(gè)方面給出評(píng)分[3]：1分，效果欠佳(染色質(zhì)量嚴(yán)重影響病理診斷，會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的診斷結(jié)果的可能)；2分，效果一般(染色質(zhì)量不會(huì)嚴(yán)重影響病理診斷，但會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤診斷結(jié)果的可能)；3分，效果較好(染色質(zhì)量能夠滿足病理診斷的需要，但需要進(jìn)行改進(jìn))；4分，效果優(yōu)秀(染色質(zhì)量滿足病理診斷的需要)。1～2分為陰性，3～4分為陽(yáng)性。

1.2.4 IHC染色：IHC染色采取EnVision法染色，各指標(biāo)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照， ki-67和caspase9以扁桃體組織、stab-2和Bax以乳腺癌組織、survivin以胃癌組織為陽(yáng)性對(duì)照；同時(shí)使用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。ki-67和stab-2陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞核，根據(jù)染色強(qiáng)度和表達(dá)的完整性分級(jí)：陰性為0；弱陽(yáng)性為1+；陽(yáng)性為2+；強(qiáng)陽(yáng)性為3+。其中0和1+為低表達(dá)，2+和3+為高表達(dá)。survivin、caspase9和Bax陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，在光鏡下觀察免疫組化標(biāo)記的結(jié)果，未復(fù)染的切片做圖像定量分析，其方法為：將每種抗體免疫組化染色后的切片放在顯微鏡下，在同一組的每張切片相同部位觀察10個(gè)視野(3種抗體×10=30個(gè)視野)，被測(cè)物質(zhì)的各種信息通過(guò)攝像機(jī)將所測(cè)目標(biāo)轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖像，標(biāo)定組織片空白處入射光的吸光度值(absorbance,A)，在監(jiān)視器上用不同的分割方法和編輯功能計(jì)算免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞平均A值，代表切片中相應(yīng)抗原的相對(duì)強(qiáng)度。

1.2.5 熒光原位雜交(FISH)法檢測(cè)基因擴(kuò)增:組織切片置于65 ℃下烘烤3 min，然后浸入二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10 min；浸入100%乙醇中5 min；依次室溫置于100%、85%和70%乙醇各2 min；室溫浸入去離子水中3 min，用無(wú)絨紙巾吸取多余的水分；90 ℃沸水煮玻片20 min，蛋白酶K消化5 min；置于2×SSC溶液中漂洗5 min,漂洗2次；再將玻片依次置于70%、85%和100%乙醇中各2 min脫水；自然干燥玻片；加探針，蓋玻片封片；雜交儀83 ℃變性5 min，42 ℃過(guò)夜雜交。玻片洗滌：46 ℃ NP40 5 min，2×SSC 5 min，室溫70%乙醇3 min。DAPI復(fù)染后鏡下觀察。以脂肪肉瘤組織作陽(yáng)性對(duì)照，用預(yù)雜交液代替雜交液作陰性對(duì)照。使用25×物鏡，觀察雜交區(qū)域并定位計(jì)數(shù)的靶細(xì)胞。壞死區(qū)域和細(xì)胞核邊界模糊都不選擇計(jì)數(shù)范圍。無(wú)法客觀判斷信號(hào)的細(xì)胞不計(jì),僅對(duì)那些信號(hào)分離的細(xì)胞計(jì)數(shù)。有效細(xì)胞數(shù)≥30為陽(yáng)性；有效細(xì)胞數(shù)<30為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色

表面脫鈣組與常規(guī)脫鈣組HE切片染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)對(duì)比鮮明部分(圖1)。兩者評(píng)分無(wú)明顯差異。

圖1 兩組骨肉瘤組織HE染色結(jié)果比較Fig 1 Comparison of HE staining images for the two kinds of osteosarcoma specimens

2.2 IHC

定位于核的抗原ki-67和statb2表面脫鈣組表達(dá)均強(qiáng)于常規(guī)脫鈣組(P<0.05)(表1)， 且染色背景干凈(圖2)。定位于細(xì)胞質(zhì)的抗原survivin、 caspase9和Bax表面脫鈣組吸光度值(26.14±3.25)明顯高于常規(guī)脫鈣組(9.36±2.45)(P<0.05)；其中caspase9和Bax表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)，定位準(zhǔn)確，背景干凈(圖2)。

2.3 FISH

表面脫鈣組MDM2探針熒光原位雜交檢測(cè)背景為黑色，沒(méi)有熒光顆粒及模糊的熒光背景；探針信號(hào)明亮，清楚且易于觀察；常規(guī)混合酸脫鈣組熒光原位雜交檢測(cè)細(xì)胞核模糊不清，有強(qiáng)烈的噪音背景(圖3)。有效細(xì)胞計(jì)數(shù)常規(guī)脫鈣組(2例)明顯低于表面脫鈣組(5例)(P<0.05)。

表1 ki-67和stab-2表達(dá)Table 1 Expression of ki-67, stab-2

3 討論

骨肉瘤疾病的鑒別診斷和臨床治療均需要使用免疫組化技術(shù)(IHC)檢測(cè)相關(guān)的抗原的表達(dá)；靶向藥物的使用需要利用熒光原位雜交(FISH)分析MDM2基因的擴(kuò)增。病理科處理骨肉瘤組織標(biāo)本應(yīng)用的脫鈣液及脫鈣方法容易影響組織及細(xì)胞的抗原性[4]，導(dǎo)致免疫組化檢測(cè)出現(xiàn)假陰性；破壞細(xì)胞中的mRNA成分，探針無(wú)法與mRNA成分結(jié)合從而使FISH檢測(cè)失敗[5-6]。本研究使用的蠟塊表面脫鈣法可以解決常規(guī)脫鈣法的技術(shù)弊端。

圖2 兩組骨肉瘤組織IHC染色結(jié)果比較Fig 2 Comparison of immunohistochemistry staining images for the two kinds of osteosacoma specimens

圖3 FISH結(jié)果Fig 3 Fluorescence in situ hybridization images

應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)骨組織抗原及應(yīng)用熒光原位雜交法檢測(cè)mRNA最有效的脫鈣劑是EDTA[6]。其缺點(diǎn)是對(duì)大塊骨組織脫鈣時(shí)間需要1個(gè)月甚至更長(zhǎng)[7]。不能滿足病理科日常工作需要。研究結(jié)果顯示， 脫鈣液對(duì)組織的損傷會(huì)隨著溶液酸性的增加和脫鈣時(shí)間延長(zhǎng)而加重[8]。但短時(shí)間酸浸泡對(duì)組織細(xì)胞形態(tài)和大部分抗原的免疫組織化學(xué)染色效果影響不大[9]。10%鹽酸常常用于石蠟包埋后骨組織的脫鈣[10]。表面脫鈣法就是基于此基礎(chǔ)。表面脫鈣液主要成分為10%緩沖甲醛鹽酸溶液。首先，高濃度的鹽酸快速作用于蠟塊骨組織表面脫去鈣質(zhì)，形成薄薄的脫鈣層表面，有效減少了酸對(duì)抗原及mRNA的作用時(shí)間，在滿足檢測(cè)切面數(shù)的需要的情況下將對(duì)抗原及核酸的影響降到最低；其次，表面脫鈣法的蠟塊組織經(jīng)過(guò)甲醛的充分固定后，甲醛與蛋白質(zhì)充分交聯(lián)，有效保護(hù)了抗原及mRNA免受酸的破壞。但是表面脫鈣法也有顯著的缺點(diǎn)：在需要對(duì)骨肉瘤病例進(jìn)行回顧性檢測(cè)時(shí)，需再次進(jìn)行表面脫鈣。