鼻敏感顆粒對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠模型細(xì)胞因子的影響

陳 琴，黃益燈

(溫州醫(yī)科大學(xué)， 浙江 溫州 325000)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的疾病，是耳鼻喉科常見(jiàn)的疾病[1]。該疾病發(fā)病率高，臨床表現(xiàn)多為打噴嚏、鼻塞和鼻癢，嚴(yán)重影響患者工作效率和生活質(zhì)量[2]。目前臨床上變應(yīng)性鼻炎的治療方式主要是避免接觸變應(yīng)原治療和藥物治療。研究報(bào)道鼻敏康顆粒治療AR療效顯著，具有療效持久和不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)[3]。但是有關(guān)鼻敏感顆粒治療AR機(jī)制方面的研究較少。本研究通過(guò)構(gòu)建變異性鼻炎大鼠模型，給予模型大鼠鼻敏感顆粒治療，通過(guò)測(cè)定白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素17(interleukin17，IL-17)、白介素18(interleukin18，IL-18)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)水平及T-bet(T-box expressed in T cell)、GATA-3蛋白和基因表達(dá)量，探討鼻敏感顆粒對(duì)AR大鼠細(xì)胞因子的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，40只，雄性[上海斯萊克動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證分別為SCXK(滬)2017-0005和SYXK2015-009]。

1.1.2 主要試劑：QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(上海恒斐生物科技有限公司)；SYBR Green qPCR Mix(上海澤葉生物科技有限公司)；ECL顯色試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)；Tris-Hcl緩沖液(上海源葉生物科技有限公司)；IL-1β、IL-17、IL-18和TGF-β1 ELISA試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；鼻敏感顆粒(生黃芪10 g、桂枝12 g、五味子6 g、烏梅9 g、黨參10 g、地龍10 g、干姜9 g、甘草3 g、辛夷6 g)由浙江省中醫(yī)院制劑實(shí)驗(yàn)室提供；GATA-3和T-bet單克隆抗體(艾美捷科技有限公司)；GATA-3和T-bet引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組(用卵清蛋白為致敏原構(gòu)建變異性鼻炎大鼠模型)、氯雷他定組和鼻敏感康顆粒組，每組各10只。腹腔注射卵清蛋白(OVA)混懸液，1次/2 d，共8次。注射完成后的次日將0.5% OVA氯化鈉溶液滴入雙側(cè)鼻腔，50 μL/側(cè)，1次/d，共7次。觀察7 d后大鼠是否出現(xiàn)抓鼻、噴嗔、流涕等癥狀，采用癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]評(píng)價(jià)造模情況，評(píng)分超過(guò)5分為造模成功。3組大鼠模型均構(gòu)建成功，氯雷他定組采用10 g/(kg·d)氯雷他定溶液進(jìn)行灌胃治療，鼻敏感顆粒組采用10 g/(kg·d)鼻敏感顆粒湯液進(jìn)行灌胃治療，鼻敏感顆粒劑量根據(jù)成人劑量的5、10和15倍給藥，經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇并調(diào)整為最佳治療濃度[5]。氯雷他定是陽(yáng)性對(duì)照組?？瞻捉M和模型組每天給予同等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃治療，連續(xù)治療28 d。

1.2.2 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子：取各組大鼠治療后的外周血500 μL，離心取上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 Western blot檢測(cè)GATA-3和T-bet蛋白表達(dá)：1)使用過(guò)量的10%水合氯醛將大鼠麻醉致死，取大鼠鼻黏膜組織100 mg，提取總蛋白，凍存?zhèn)溆茫?)測(cè)定其蛋白濃度并調(diào)整后進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后使用5%牛奶封閉1 h；3)采用GATA-3或者T-bet單克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜后孵育山羊抗大鼠IgG二抗1 h，洗膜后使用ECL顯色液顯色，進(jìn)行曝光。使用Imag J軟件對(duì)各組條帶進(jìn)行吸光度分析，以β-actin為參照，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 q-PCR檢測(cè)GATA-3和T-bet基因表達(dá)：取大鼠鼻黏膜組織100 mg，使用手術(shù)剪刀將其剪碎，嚴(yán)格按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行組織總RNA的提取。使用Ninodrop儀器測(cè)定RNA的純度和濃度。嚴(yán)格按照QIAGEN OneStep RT-PCR Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。嚴(yán)格按照SYBR Green qPCR Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行q-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；以β-actin為參照，進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以2-△△Ct表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠IL-1β、IL-17、IL-18和TGF-β1水平比較

與對(duì)照組比較，模型組IL-1β、IL-17和IL-18水平升高，TGF-β1水平降低(P<0.05)；與模型組比較，鼻敏感顆粒組和氯雷他定組IL-1β、IL-17和IL-18降低，TGF-β1水平升高(P<0.05)(表1)。

2.2 各組大鼠GATA-3和T-bet蛋白表達(dá)量比較

與對(duì)照組比較，模型組GATA-3蛋白表達(dá)水平升高，T-bet蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組比較，鼻敏感顆粒組和氯雷他定組GATA-3蛋白表達(dá)水平降低，T-bet蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖1)。

2.3 各組大鼠GATA-3和T-bet基因表達(dá)量比較

與對(duì)照組比較，模型組GATA-3基因水平升高，T-bet基因表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組比較，鼻敏感顆粒組和氯雷他定組GATA-3基因表達(dá)水平降低，T-bet基因表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖2)。

3 討論

AR是一種較難治愈但是可以長(zhǎng)期控制癥狀的疾病，在中國(guó)該病發(fā)病率為11%[6]。變應(yīng)性鼻炎是由于吸入過(guò)敏原物質(zhì)造成機(jī)體Th1和Th2平衡失調(diào)，以Th2免疫反應(yīng)為主的炎性反應(yīng)疾病。中醫(yī)認(rèn)為變應(yīng)性鼻炎是肺脾虛寒癥候。鼻敏感顆粒具有補(bǔ)益肺脾和祛風(fēng)止癢的功效，其在臨床上具有良好的療效，可顯著改善鼻炎癥狀[7]，但該藥物的作用機(jī)制研究較少。本研究通過(guò)構(gòu)建AR模型大鼠研究鼻敏感顆粒的具體作用機(jī)制。

Th1/Th2細(xì)胞因子平衡與AR疾病的發(fā)生具有密切關(guān)系[8-10]。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，與炎性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。IL-1β又稱為前炎性因子，具有促進(jìn)Th17細(xì)胞分化并分泌IL-17的作用。IL-18和TGF-β1可促進(jìn)炎性的發(fā)生和Th2反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，模型組IL-1β、IL-17和IL-18水平升高，TGF-β1水平降低；與模型組比較，鼻敏感顆粒組和氯雷他定組IL-1β、IL-17和IL-18降低，TGF-β1水平升高。結(jié)果提示：1)炎性因子的異常表達(dá)可能是Th1/Th2失衡的重要原因；2)鼻敏感顆粒能夠通過(guò)下調(diào)IL-1β、IL-17、IL-18表達(dá)，上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，進(jìn)而發(fā)揮降低AR大鼠鼻部炎性反應(yīng)的作用。這與報(bào)道是一致的，炎性因子的異常表達(dá)會(huì)破壞Th1/Th2平衡。而鼻敏感方(顆粒)能有效治療AR，且可調(diào)節(jié)IL-17和IL-10的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，發(fā)揮治療疾病的作用[11-12]。

表1 各組大鼠IL-1β、IL-17、IL-18和TGF-β1水平比較Table 1 Comparison of the levels of IL-1β, IL-17, IL-18 and TGF-β1 in rats of each

*P<0.05 compared with control group； #P<0.05 compared with model group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group

GATA-3表達(dá)于Th2細(xì)胞中，促進(jìn)Th細(xì)胞分化為Th2。T-bet表達(dá)于Th1細(xì)胞及胸腺細(xì)胞中，促進(jìn)分化的Th2細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。研究表明GATA-3和T-bet可以體現(xiàn)Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的分化水平[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，模型組GATA-3蛋白和基因表達(dá)水平升高，T-bet蛋白和基因表達(dá)水平降低。結(jié)果提示了GATA-3/T-bet失衡可能是AR發(fā)生的原因之一；與模型組比較，鼻敏感顆粒組和氯雷他定組GATA-3蛋白和基因表達(dá)水平降低，T-bet表達(dá)蛋白和基因水平升高。結(jié)果提示鼻敏感顆粒能夠上調(diào)T-bet的表達(dá)，下調(diào)GATA-3的表達(dá)，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，進(jìn)而發(fā)揮治療AR疾病的效果。這與報(bào)道是一致的，大鼠GATA-3/T-bet的表達(dá)失衡會(huì)導(dǎo)致Th1/Th2平衡失調(diào)，從而發(fā)生AR[14]。本研究只是初步探討了鼻敏感顆粒治療AR的可能機(jī)制，但是研究的樣本量小，且未對(duì)不同劑量鼻敏感顆粒的治療效果差異進(jìn)行分析。

綜上所述，鼻敏感顆?？赏ㄟ^(guò)上調(diào)T-bet的表達(dá)，下調(diào)GATA-3的表達(dá)，調(diào)控Th1和Th2細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)IL-1β、IL-17、IL-18和TGF-β1水平，進(jìn)而糾正Th1/Th2免疫失衡，減輕鼻部炎性反應(yīng)，達(dá)到治療AR的目的。