大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向血管平滑肌細胞分化過程中小窩蛋白-1表達增強

周芳亮，何迎春，閆慶梓，張凱強，廖端芳*

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室； 2.湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評價湖南省重點實驗室干細胞中藥調(diào)控與應(yīng)用實驗室, 湖南 長沙 410208)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的表型轉(zhuǎn)換和異常增殖是動脈粥樣硬化等血管重塑性疾病形成和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[1-2]。研究表明血管重塑中的平滑肌細胞可來源于干細胞，并且參與血管重塑和新內(nèi)膜增生過程[3- 4]。因此，研究干細胞分化為VSMCs的具體機制對于全面理解血管重塑疾病病理過程具有重要的意義。

小窩蛋白(caveolin-1)是形成細胞表面小凹結(jié)構(gòu)的主要成分，在保持小凹的完整性、膽固醇結(jié)合、信號的傳導(dǎo)中起著重要作用[5]。前期研究表明小窩蛋白-1在調(diào)節(jié)VSMCs增殖、表型轉(zhuǎn)化方面起重要作用[6]，然而其在干細胞向VSMCs分化中的作用尚不是十分清楚。本研究以骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)分化為VSMCs過程為研究對象，探討小窩蛋白-1在該過程中的表達變化，為研究其在干細胞向VSMCs分化過程的具體機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級SD雄性大鼠(體質(zhì)量50～70 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,合格證號：43004700022681)；DMEM低糖培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；干細胞成骨、成軟骨及成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司)；干細胞鑒定流式抗體(Ebiosience公司)；阿利新藍、茜素紅和油紅O(Sigma-Aldrich公司)；TGF-β 1(Protech公司)； SM-MHC抗體、SM22α和myocardin抗體(Abcam公司)；caveolin-1抗體、tublin抗體、GAPDH抗體與辣根過氧化物酶標記羊抗兔(Cell Signaling Technology公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs細胞的原代培養(yǎng):頸椎脫臼處死大鼠，用75%乙醇充分消毒后無菌條件下迅速取出股骨，將表面的肌肉及筋膜剝離干凈，剪去兩端。用5 mL的注射器吸取DMEM低糖培養(yǎng)液從一端開口處插入骨中沖洗骨髓腔，從另一端收集沖洗液，反復(fù)沖洗，將沖洗液直接接種于25 mL的玻璃培養(yǎng)瓶中，于飽和濕度、37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。48 h后換液去除未貼壁細胞，每3 d換液1次。細胞增殖至80%匯合時，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2次，0.1%的胰蛋白酶消化2 min后終止消化，用吸管輕輕吹打瓶底，利用 BMSCs 易脫落的特點將先被消化下來的BMSCs 與貼壁性較強的單核細胞、巨噬細胞等雜細胞分離。將細胞進行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞的增殖、形態(tài)變化并拍照。

1.2.2 細胞表面分子的鑒定:選擇增殖良好的P3代細胞，消化后1 000 r/min離心4 min，棄上清液，加PBS洗2次，用PBS重懸細胞分裝到0.5 mL離心管中，使每管的細胞量達到106個、 液體量為100 μL，加入5 μL抗體，避光室溫孵育25 min，300 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀對細胞表面標志物CD90、CD105、 CD45和CD11進行檢測。

1.2.3 細胞分化能力的鑒定: 取第3代(P3)細胞，加入間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)液、間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)液，15、20 d后分別進行油紅O、茜素紅染色；加入間充質(zhì)干細胞成軟骨誘導(dǎo)液，細胞成團后石蠟包埋切片，阿利新藍染色，倒置顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.2.4 TGF-β1誘導(dǎo)BMSCs分化:將增殖良好的對數(shù)期P3代BMSCs細胞消化后接種到2個6 cm培養(yǎng)皿中，24 h后分別用普通培養(yǎng)基(DMEM低糖培養(yǎng)液、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(DMEM低糖培養(yǎng)液、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素、5 ng/mL TGF-β1)培養(yǎng)10 d。

1.2.5 Western blot檢測TGF-β1誘導(dǎo)BMSCs 后各組細胞小窩蛋白-1的表達:選擇增殖良好的對數(shù)期P3代BMSCs細胞,消化后接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，貼璧24 h后，用5 ng/mL TGF-β1對其分別誘導(dǎo)0、3、9和12 d，用預(yù)冷PBS清洗細胞3次，吸盡殘留的PBS，加入含1% PMSF的RIPA裂解液處理15 min，4 ℃條件下1 000×g離心5 min取上清，BCA法測定蛋白濃度。每組取30 μg總蛋白，10% SDS-PAGE分離蛋白，運用電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。含5%脫脂牛奶TBST封閉1 h后加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后孵育二抗1 h，化學(xué)發(fā)光法ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的鑒定

鏡下可見P3代BMSCs細胞呈漩渦樣狀增殖(圖1)，細胞經(jīng)過誘導(dǎo)后，可向軟骨細胞、脂肪細胞和骨細胞分化(圖2)。BMSCs高表達細胞表面抗原CD90、CD105,低表達CD45、CD11(圖3)。

2.2 體外誘導(dǎo)BMSCs分化為VSMCs

與正常未誘導(dǎo)組相比，5 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)BMSCs細胞10 d后，血管平滑肌細胞標記SM-MHC和SM22α的表達明顯增加，同時caveolin-1的表達增加(圖4)。

圖1 吉姆薩染色BMSCs細胞Fig 1 Giemsa stained BMSCs(×200)

A.chondrogenic differentiation(Ali new blue staining ×100)； B.adipogenic differentiation(Oil Red O staining ×200)；C.osteoplastic differentiation(Alizarin red staining ×200)

圖3 流式細胞儀鑒定BMSCs表面分子標志Fig 3 BMSCs surface molecules identified by flow cytometry

2.3 小窩蛋白-1在BMSCs向VSMCs分化過程中的表達變化

5 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)BMSCs不同時間后發(fā)現(xiàn)caveolin-1、SM-MHC的表達隨TGF-β1誘導(dǎo)時間的延長而增強，同時myocardin的表達增強(圖5)。

3 討論

平滑肌細胞的增殖和遷移是血管重塑性疾病形成和發(fā)展的重要因素[2]。目前已證實VSMCs存在兩種亞型：收縮型(cSMC)和增殖型(pSMC)。大量研究發(fā)現(xiàn)，在血管受損環(huán)境下，新生血管內(nèi)膜中的pSMC數(shù)量明顯增多[4]。普遍認為，VSMCs具有表型可塑性，血管內(nèi)皮損傷時cSMC可去分化成為pSMC，pSMC從中膜遷移至內(nèi)膜，增殖、分泌細胞外基質(zhì)蛋白。即經(jīng)典的“血管平滑肌細胞去分化理論”[7]。然而近年的研究發(fā)現(xiàn)干細胞的分化才是內(nèi)膜下VSMCs的來源，也是導(dǎo)致心血管疾病的重要原因[3]。這對經(jīng)典的收縮型平滑肌細胞“去分化理論”提出了嚴峻挑戰(zhàn)并引起廣泛關(guān)注。但同時眾多血管生物學(xué)知名學(xué)者對VSMCs的干細胞源性提出了質(zhì)疑，然而這些學(xué)者也同時認為在這一重要領(lǐng)域的進一步探索是必需的[8]。因此通過不同途徑來證實干細胞向血管平滑肌細胞分化的存在及其調(diào)節(jié)機制，有助于明確VSMCs的來源，闡明動脈粥樣硬化等血管重塑性疾病的發(fā)病機制。本研究驗證了骨髓間充質(zhì)干細胞可以體外誘導(dǎo)分化為平滑肌細胞,從側(cè)面證實平滑肌細胞干細胞源性的可能性。

*P<0.05 compared with 0 day group

*P<0.05 compared with 0 day group; #P<0.05 compared with 3 days group; ☆P<0.05 compared with 9 days group

近年，小窩蛋白-1調(diào)節(jié)干細胞分化方面受到較多的關(guān)注。小窩蛋白-1表達增加是趨于衰老的人間質(zhì)干細胞(hMSC)逐漸失去成脂細胞分化潛能的主要原因[9]。Baker N發(fā)現(xiàn)小窩蛋白-1可調(diào)控間質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[10]。而小窩蛋白-1在間充質(zhì)干細胞向血管平滑肌細胞的分化過程的作用及機制尚待研究。本研究表明在BMSCs分化為VSMCs的過程中小窩蛋白-1表達的水平隨TGF-β1誘導(dǎo)時間的延長而增強，提示小窩蛋白-1可能參與了干細胞來源的平滑肌細胞的形成。此外，在該過程中心肌素蛋白(myocardin)的表達增加，而心肌素蛋白是一種心肌和平滑肌特異性的血清應(yīng)答因子(serum response factor, SRF)的輔助因子，是心肌和SMC發(fā)育和分化的關(guān)鍵決定因素[11]。心肌素蛋白進入細胞核后可與SRF結(jié)合促進CArG盒依賴性的收縮基因轉(zhuǎn)錄(如SMα-actin、SM-MHC和 SM22α等)，從而促進pSMC分化為cSMC[12-13]。另有報道心肌素蛋白參與干細胞分化為平滑肌細胞的過程[14-15]。小窩蛋白-1是否可通過心肌素蛋白來調(diào)控干細胞的分化有待進一步研究驗證。

綜上所述, 本研究結(jié)果表明，BMSCs在向VSMCs分化過程中小窩蛋白-1表達增強，提示小窩蛋白-1與干細胞源性的VSMCs的形成有關(guān)。推測其可能通過心肌素蛋白來調(diào)控該分化過程，為進一步研究干細胞分化為血管平滑肌細胞的具體機制提供了基礎(chǔ)。