不同嚴(yán)重程度急性胰腺炎患者血小板線粒體氧化功能比較

黃建剛，楊青，胡翠，馮慧，鮑峻峻，王兵兵，梅俏，許建明

(1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥230022；2馬鞍山市人民醫(yī)院)

急性胰腺炎(AP)是臨床常見的急重癥，有20%～30%的AP患者可發(fā)展成重癥急性胰腺炎(SAP)，引起多器官功能障礙，導(dǎo)致死亡[1]。全身炎癥反應(yīng)(SIR)是AP多器官功能障礙發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)常見于膿毒癥、外傷、燒傷、急性胰腺炎等疾病[2]。線粒體功能障礙可抑制細(xì)胞能量生成及氧自由基的異常增多，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，擴(kuò)大和加重炎癥反應(yīng)過程,因此，線粒體在SIRS中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，血小板中具有數(shù)量眾多的有功能的線粒體[3]，在AP過程中血小板功能會(huì)發(fā)生顯著變化[4]。超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性可反映機(jī)體血小板抗氧化能力，丙二醛(MDA)可反映機(jī)體血小板受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。琥珀酸脫氫酶(SDH)和ATP酶均與線粒體氧化磷酸化有關(guān)。線粒體損傷時(shí)，因氧化磷酸化功能受到抑制，線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變即線粒體腫脹度增加，影響線粒體正常功能。本研究通過檢測(cè)AP患者血小板中線粒體有關(guān)氧化損傷和能量代謝功能指標(biāo)的變化，為AP病情評(píng)估和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年9月～2017年3月我院收治的AP患者40例，均符合急性胰腺炎診治指南(2014)制定的診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)[5]，按病情嚴(yán)重程度分為輕癥急性胰腺炎(MAP)組25例、中度重癥急性胰腺炎(MSAP)組12例、SAP組3例。MAP組男15例、女10例，年齡(57.76±13.92)歲，APACHE-Ⅱ評(píng)分(3.24±2.71)分，BISAP評(píng)分(1.00±1.04)分，改良CT評(píng)分(2.48±0.87)分；MSAP組男9例、女3例，年齡(68.17±15.19)歲，APACHE-Ⅱ評(píng)分(6.58±2.50)分，BISAP評(píng)分(2.25±0.87)分，改良CT評(píng)分(3.00±1.04)分；SAP組男2例、女1例，年齡(66.67±12.09)歲，APACHE-Ⅱ評(píng)分(11.67±0.58)分，BISAP評(píng)分(6.00±5.19)分，改良CT評(píng)分(4.67±1.15)分。對(duì)照組為同期我院健康查體者9例，男4例、女5例，年齡20～50歲。各組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 血小板的制備 AP患者于入院后24 h內(nèi)、對(duì)照組空腹12 h后，采集空腹靜脈血10 mL，EDTA抗凝，4 ℃離心20 min，取上清即為富含血小板的血漿。將血漿4 ℃離心10 min，棄上清，所得沉淀即為血小板。加入與血漿等體積的生理鹽水將血小板重懸，室溫保存待測(cè)。

1.3 血小板SOD、MDA、GSH-Px、SDH、ATP酶水平檢測(cè) 采用BCA法。取適量血小板懸液，使用分光光度計(jì)(比色法)檢測(cè)GSH-Px、ATP酶、MDA、SDH水平，使用酶標(biāo)儀(比色法)檢測(cè)SOD水平。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，按試劑盒說明書操作。

1.4 血小板線粒體腫脹度檢測(cè)[6]取適量血小板懸液，按細(xì)胞線粒體提取試劑盒說明書提取線粒體。配制腫脹度測(cè)定液，腫脹度測(cè)定液1：蔗糖250 mmol/L，琥珀酸鹽3 mmol/L，KH2PO45 mmol/L；腫脹度測(cè)定液2：蔗糖250 mmol/L，琥珀酸鹽3 mmol/L，KH2PO45 mmol/L，CaCl20.3 mmol/L。將1 mg待測(cè)線粒體樣品與1 mL測(cè)定液1或2混勻，以參比杯調(diào)零。于25 ℃、0～10 min內(nèi)連續(xù)測(cè)定線粒體樣品在520 nm處的吸光度A值。由于線粒體腫脹時(shí)，其吸光度在一定波長(zhǎng)下降低，因此以吸光度A值的降低值表示線粒體腫脹度。

2 結(jié)果

2.1 各組血小板SOD、GSH-Px、MDA水平比較 與對(duì)照組比較，MAP組、MSAP組、SAP組MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低；與MAP及MSAP組比較，SAP組血小板MDA水平增高，SOD、GSH-Px水平降低(P均<0.05)。見表1。

表1 不同程度AP患者血小板SOD、GSH-Px、MDA水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05。

2.2 各組血小板ATP酶、SDH水平比較 與對(duì)照組比較，MSAP組、SAP組血小板ATP酶及SDH水平降低；與MSAP組比較，SAP組血小板ATP酶和SDH水平降低(P均<0.05)。見表2。

表2 不同程度AP患者血小板ATP酶、SDH水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05。

2.3 各組血小板線粒體腫脹度比較 加入測(cè)定液后，對(duì)照組吸光度逐漸下降，MAP組吸光度下降幅度較對(duì)照組低，MSAP組吸光度下降幅度較MAP組低，SAP組吸光度下降幅度較MSAP組低(P均<0.05)。見表3、4。

表3 各組加入測(cè)定液1后血小板線粒體腫脹度比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與MAP組比較，#P<0.05；與MSAP組比較，☆P<0.05。

表4 各組加入測(cè)定液2后血小板線粒體腫脹度比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與MAP組比較，#P<0.05；與MSAP組比較，☆P<0.05。

3 討論

AP是由多種病因引起的胰酶激活，繼以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征，研究表明，氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙參與了胰腺腺泡細(xì)胞損傷的過程[7]。線粒體的主要功能是通過氧化磷酸化產(chǎn)生細(xì)胞代謝必需的能量物質(zhì)ATP。此外，線粒體介導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生和清除，線粒體是產(chǎn)生活性氧(ROS)的主要部位，當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí)，氧應(yīng)激被過度激活，活性氧合成增多，抑制線粒體的生物合成和穩(wěn)態(tài)維持，損傷線粒體膜使膜電位下降，導(dǎo)致ATP生成減少及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在雨蛙肽誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性AP模型中，早期可出現(xiàn)胰腺腺泡上皮細(xì)胞的線粒體電子傳遞系統(tǒng)的功能障礙，胰腺線粒體合成ATP的能力下降，ROS水平明顯增高，ROS增高程度與AP嚴(yán)重程度有關(guān)[8]。因此，胰腺線粒體中異常增加的氧化反應(yīng)或降低的抗氧化能力是AP發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)。

盡管在AP的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜蛔C實(shí)存在線粒體功能的改變，但是在AP患者中獲得胰腺組織進(jìn)行活檢來檢測(cè)線粒體功能很難實(shí)現(xiàn)且不符合倫理。因此，檢測(cè)外周血中的線粒體功能是了解AP患者機(jī)體線粒體功能的一種可行方法[9]。研究表明，血小板的線粒體功能障礙與膿毒血癥的臨床疾病活動(dòng)度有關(guān)[10]。在膿毒血癥和心源性休克患者血小板中，線粒體呼吸功能受到抑制，ATP生成減少[11]。在連續(xù)流動(dòng)左心室輔助裝置植入術(shù)后發(fā)生SIRS的患者中，血小板線粒體膜電位明顯升高，線粒體損傷嚴(yán)重[12]。SIRS是SAP病理生理過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此了解血小板中線粒體功能的變化對(duì)探討AP發(fā)病過程中炎癥損傷的機(jī)制具有重要意義。

氧化損傷是引起AP發(fā)病的重要因素，SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化因子，通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能完整。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AP患者血小板中MDA水平升高，SOD和GSH-Px活性降低；SAP組MDA水平高于MAP組和MSAP組，SOD和GSH-Px活性低于MAP組和MSAP組。表明AP患者機(jī)體抗氧化能力受到抑制，氧化損傷作用增強(qiáng)，其中SAP患者氧化損傷作用增強(qiáng)及抗氧化作用抑制更明顯。

SDH是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，參與細(xì)胞能量代謝，ATP酶可催化ATP分解為ADP釋放能量，均與線粒體氧化磷酸化及能量供應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AP患者血小板中SDH和ATP酶活性降低；SAP組SDH和ATP酶活性低于MAP組和MSAP組。表明AP患者氧化磷酸化及能量合成功能下降，其中SAP患者線粒體氧化磷酸化及能量合成功能抑制更明顯。線粒體是細(xì)胞能量合成場(chǎng)所，AP發(fā)病抑制線粒體功能，SDH及ATP酶活性降低，導(dǎo)致機(jī)體能量代謝紊亂，提示線粒體能量合成功能受損與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

AP可導(dǎo)致線粒體腫脹、線粒體膜去極化。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道開放引起的線粒體腫脹，吸光度在一定波長(zhǎng)下減少。通過測(cè)定吸光值變化能夠反映線粒體的腫脹度。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AP患者線粒體腫脹變化不明顯，提示線粒體因結(jié)構(gòu)及功能遭受破壞，對(duì)外環(huán)境酸堿度及Ca2+的變化不敏感；其中SAP組線粒體腫脹下降明顯低于MSAP及MSAP患者血小板線粒體，提示SAP組血小板線粒體損傷更為明顯，導(dǎo)致對(duì)外環(huán)境酸堿度及Ca2+的變化更加不敏感。因此，SAP組血小板線粒體功能損傷較MAP組和MSAP組更嚴(yán)重。提示線粒體功能損傷程度與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

綜上所述，AP患者血小板線粒體受到氧化損傷，能量合成功能受到抑制，SAP患者的受損程度更嚴(yán)重。