庫爾勒香梨自交不親和SFBB-γ基因F-box區(qū)和可變區(qū)V3 RNAi表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

鐘穎，馮建榮*，劉海楠，李文慧，呂文娟，田雯

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團重點實驗室，新疆 石河子 832003）

梨屬（PyrusL.）屬薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomoideae）[1]，其品種繁多且資源非常豐富。庫爾勒香梨（Pyrusbretschneideri Rehd）是新疆重點發(fā)展的特色果樹品種之一[2]，但庫爾勒香梨自花授粉結(jié)實力低，是極具代表性的配子體型自交不親和性（Gametophytic self-incompatibility，GSI）果樹[3]，生產(chǎn)上常采用蜜蜂授粉或人工授粉的方式來提高經(jīng)濟效益，這使梨園的管理變得復(fù)雜化，加大了投入成本，所以，針對其自交不親和性機理展開深層次探究，優(yōu)選培育自交親和性香梨品種對實際生產(chǎn)有著重要意義。

果樹自交不親和性由S位點復(fù)等位基因控制[4]，該位點的基因至少包括雌蕊決定子S-RNase基因和編碼 F-box蛋白的花粉S基因[5]?，F(xiàn)階段以薔薇科的果樹S-RNase基因為方向的探究活動獲取了諸多的成果，在李屬果樹中也已經(jīng)確定花粉S決定子的最佳候選基因為 SLF（S locus F-box gene）/SFB（S haplotypespecific F-box gene）基因[6]，梨亞科花粉 S單元型中具有諸多的同源拷貝，F(xiàn)-box基因家族十分龐大，目前從梨屬和蘋果屬果樹中分離鑒定出的多數(shù)為 SFBB（S locus F-box brothers）基因[7]，該類基因N端有一個F-box結(jié)構(gòu)域，由40-50氨基酸所聚合而成，和S-RNase基因連鎖同時在花粉里呈現(xiàn)出特異性表達，具有S等位基因的多態(tài)性，因而在諸多的梨亞科花粉S決定子的候選基因當(dāng)中被視作首選[8]。Cheng等[9]最先在蘋果（Malus × domestica）花粉中克隆到了S單元型多態(tài)性基因MdSLFB1（SLFB ：S-RNase linked F-box） 和 MdSLFB2；Sassa等[7]通過篩選BAC文庫的方法克隆到了4個蘋果SFBB 基 因（MdSFBB3-α、MdSFBB3-β、MdSFBB9-α和MdSFBB9-β）和6個梨屬SFBB基因。在S位點內(nèi)，S-RNase基因的兩端均有梨屬SFBB基因存在，一個上述位點單元里SFBB基因涵蓋了諸多的序列相似性很高的基因（α、β、γ）[7]。這些基因均有S位點特性同時具有遺傳多態(tài)性，然而目前尚不清楚與S-RNase基因相互作用產(chǎn)生自交不親和性的到底是哪一類或哪幾類SFBB基因，還需要對這些基因的結(jié)構(gòu)、功能以及基因間的聯(lián)系等進行更深入的研究。SFBB-γ 基因是梨屬眾多SFBB基因中的一種，它由一個 F-box區(qū)域和 4 個可變區(qū)（V1、V2、V3、V4）組成，目前已有許多SFBB-γ基因被分離鑒定出來[10]。

RNAi技術(shù)具有特異性、高效性、可傳播性、遺傳性、高穩(wěn)定性和ATP依賴性[11]。這些特性保證了對目的基因的精確沉默，可用于特定基因的功能研究[12]。Jung等[13]借助RNAi技術(shù)，使油菜（B.rapa cv）的 S位點花粉識別控制基因 S60基因沉默，所得到的RNAi轉(zhuǎn)基因植株自交親和并且能夠使后代具有同等特性。與 S-RNase基因有關(guān)的其余基因會對自交不親和性造成干擾[14]，RNAi降低植物自交不親和相關(guān)因子如蘋果的 Md ABCF[15]和茄屬植物的 Sa CUL1（Cullin1蛋白）[16]表達，使其自交不親和反應(yīng)失效。這些研究為親和育種提供新的方向。所以，將此技術(shù)運用于探究SI的活動當(dāng)中，在果樹親和突變育種方面能夠收獲可喜的成效。

本研究以自交不親和庫爾勒香梨的 SFBB-γ基因為研究對象，以 SFBB-γ 基因 F-box區(qū)和可變區(qū) V3區(qū)為干擾利用目標(biāo)，利用融合 PCR構(gòu)建ihpRNA（intron-containing hairpin RNA）結(jié)構(gòu)，再結(jié)合酶切連接的方式構(gòu)建 SFBB-γ 基因的 RNAi植物表達載體，運用凍融轉(zhuǎn)化法在農(nóng)桿菌GV3101里轉(zhuǎn)進 SFBB-γ 基因的 RNAi植物表達載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化庫爾勒香梨無菌苗，通過抗性篩選和 GUS化學(xué)染色法檢測轉(zhuǎn)化的情況。

SFBB（S-haplotype-specific F-box protein）基因的F-box區(qū)和可變區(qū)與親和突變密切相關(guān)，本實驗利用 RNAi技術(shù)，對新疆重點發(fā)展的特色果樹品種‘庫爾勒香梨’的花粉 F-box區(qū)和可變區(qū) V3序列進行干擾，從而使梨自交不親和性的調(diào)節(jié)控制得以達成且成功培育出特色梨自交親和品種。本研究成果對特色梨自交親和品種的培育及自交不親和機制的研究具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

于2016年3月末至4月初，采集新疆輪臺國家果樹資源圃自交不親和庫爾勒香梨成齡樹氣球期的花，剝?nèi)』ㄋ幱陉帥龈稍锾幜栏芍辽⒎?，收集花粉置?70℃ 低溫保存。并采集1年生休眠枝條，將休眠枝條置于室內(nèi)進行浸泡催芽，用于初代外植體的培養(yǎng)，參照本實驗室的消毒方法獲得無菌苗[17]，根據(jù)本實驗室建立的庫爾勒香梨再生體系獲得再生不定芽。

GV3101農(nóng)桿菌菌株（鏈霉素抗性，Sm）和植物表達載體 pCAMBIA1304（12361pb，卡那霉素抗性，Km；含 GUS基因）由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；克隆載體 PMD19-T、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購于TAKARA-寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌菌株（DH5α）由本實驗室保存；質(zhì)粒提取試劑盒購于Omega生物技術(shù)公司(美國)，DL 2000（Marker）、2×Taq PCR Master Mix購于天根生化科技有限公司(北京)，電泳用瓊脂糖、配置所需固體/液體培養(yǎng)基的相關(guān)藥品及抗生素購于生工生物工程股份有限公司（上海）。引物合成和測序均由生工生物工程股份有限公司（上海）完成。

1.2 方法

1.2.1 序列分析及引物設(shè)計

經(jīng)生物信息學(xué)分析，本實驗室已獲得的庫爾勒香梨 SFBB-γ基因 cDNA全長序列含有 SFBB-γ基因的完整結(jié)構(gòu)，即 F-box結(jié)構(gòu)域、4個可變區(qū)（V1、V2、V3 和 V4），有研究表明，SFBB-γ 基因的F-box區(qū)域氨基酸的變異較多，氨基酸的變異存在于 V1，V3，V4中，而 V2中未發(fā)現(xiàn)[10]，故 RNAi目標(biāo)是選擇本品種的特異性變異區(qū)，其中V1片段太短，V4尚未確定獲得，故選擇 F-box區(qū)和 可變區(qū)V3作為干擾目標(biāo)，可借助RNAi技術(shù)加以影響從而達成梨的親和突變。按照RNAi表達載體的建立基本準(zhǔn)則和干擾對象，挑選 SFBB-γ基因?qū)⑾鄳?yīng)對象鎖定為F-box區(qū)及可變區(qū)V3。用Primer5.0軟件設(shè)計引物 F-box 區(qū)：FbP1、FbP2、FbP5、FbP6；可變區(qū) V3：V3P1、V3P2、V3P5、V3P6（表 1）分別擴增到 SFBB-γ基因的反向和正向片段，作為RNAi發(fā)卡結(jié)構(gòu)的兩臂（反向互補）。因為內(nèi)含子片段未出現(xiàn)在所得到的SFBB-γ片段里，為使沉默效率得到確保，插進棉花基因組DNA的序列（西南大學(xué)生物技術(shù)中心提供）設(shè)計引物 FbP3/FbP4；V3P3/V3P4擴增（表 1）作為間隔片段，用于構(gòu)建 ihpRNA結(jié)構(gòu)。通過2次PCR反應(yīng)分別融合 SFBB-γ基因 F-box區(qū)和可變區(qū)V3的正向、間隔片段、反向片段基因構(gòu)建 ihpRNA結(jié)構(gòu)。

表1 RNAi載體構(gòu)建的引物Tab.1 The primer of RNAi vector construction

1.2.2 SFBB-γ基因F-box區(qū)和可變區(qū)V3 ihpRNA的構(gòu)建

引 物 FbP1、FbP2、FbP5、FbP6；V3P1、V3P2、V3P5、V3P6分別以 SFBB-γ基因3′端全長序列的菌液為模板對SFBB-γ的F-box區(qū)及V3區(qū)的正、反向片段分別進行擴增，引物 FbP3、FbP4；V3P3、V3P4用棉花基因組DNA當(dāng)做模板對SFBB-γ的 F-box區(qū)及V3區(qū)的間隔片段進行擴增。反應(yīng)體系為25μL標(biāo)準(zhǔn)。參照劉月霞等[18]的PCR反應(yīng)程序，其中FbP1/FbP2；FbP5/FbP6退火溫度為 56 ℃；V3P1/V3P2；V3P5/V3P6退火溫度為 54 ℃；FbP3/FbP4；V3P3/V3P4退火溫度為59℃?；厥占兓械腜CR 產(chǎn)物，取1 μL回收產(chǎn)物進行1%電泳檢測，借助離心濃縮儀把其它旋轉(zhuǎn)干燥濃縮5 min（2000 rpm ，45℃），對以上產(chǎn)物進行等摩爾混雜合并，以融合 PCR完成 SFBB-RNAi構(gòu)件的融合，無需配以引物，以TaqDNA聚合酶完成各個片段的相互補充及延展，從而產(chǎn)生長的融合 PCR產(chǎn)物。融合PCR 25μL反應(yīng)體系：2×TaqMasterMix10 μL，上述等摩爾混合物10 μL。反應(yīng)程序與上述相同。1.2%電泳測試上述產(chǎn)物，對重組片段（最大片段）進行回收，待完成純化之后與（10 μL體系）克隆載體 PMD19-T相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DH5α）感受態(tài)細胞，在結(jié)束藍白斑篩選及菌液PCR鑒別判定之后測序陽性克隆，同時比較剖析所獲取的結(jié)果。正確的重組質(zhì)粒命名PMD19-RNAi-SF BB-F-box；PMD19-RNAi-SFBB-V3。

1.2.3 SFBB-γ基因F-box區(qū)和可變區(qū)V3 RNAi表達載體的構(gòu)建

以PstI及KpnI酶切pCAMBIA1304同時收回載體大片段、酶切PMD19-RNAi-SFBB重組質(zhì)粒且將目的小片段收回。受到T4DNA連接酶的影響（10 μl標(biāo)準(zhǔn)連接體系，4℃過夜，約 12 h），把目的片段連接于表達載體 pCAMBIA1304上的啟動子及終止子之間。用 PstI和 KpnI雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為 pCAMBIA1304-RNAi-SFBBF-box；pCAMBIA1304-RNAi-SFBB-V3。

1.2.4 SFBB-γ基因RNAi表達載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

采用液氮凍融法將pCAMBIA1304-RNAi-SFBBF-box；pCAMBIA1304-RNAi-SFBB-V3分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 GV3101 感受態(tài)細胞中。2 μL（約 50 ng）重組質(zhì)粒添進農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞（20 μL）之內(nèi)且將其搖晃勻稱，完成30 min冰浴之后，放進液氮中進行1min的速凍，立即進行28℃水浴待其融化，接著將液體培養(yǎng)基（不包括抗生素）800 μL YEB添入。將上述混合液置于28℃ 振蕩（180 r/min）培養(yǎng)2-3 h后6000 r/min離心1 min，倒掉上清至殘余液體100 μL左右，吸打混勻之后將其涂布含 Km（50 μg/mL）及 Sm（125 μg/mL）的 YEB 固體培養(yǎng)基上，平板倒置28℃恒溫培養(yǎng) 36-48 h后，挑選乳白色抗性菌落取出，于含Km（50 μg/mL）和Sm（125 μg/mL）的 YEB 液體培養(yǎng)基（約 5 mL）中，28℃ 180r/min振蕩培養(yǎng)過夜。用引物 FbP1和FbP6；V3P1及 V3P6分別完成菌液 PCR 檢驗，將擴增出目的條帶的菌液送樣測序。

1.2.5 庫爾勒香梨的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

把轉(zhuǎn)化有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌，劃線培養(yǎng)，挑單克隆于2 mLYEB液體培養(yǎng)基之內(nèi)，于28℃環(huán)境內(nèi)220 r/min過夜培養(yǎng)到達成飽和狀態(tài)。挑選活化較佳的菌液在上述環(huán)境中220 r/min依據(jù)1∶100在YEB培養(yǎng)基內(nèi)接種，過夜培養(yǎng)到 OD600nm=0.5的時候，對培養(yǎng)到預(yù)設(shè)狀態(tài)的農(nóng)桿菌菌液進行分裝，置于50 mL離心管之內(nèi)，每管分別為20 mL，在室溫環(huán)境中3500 r/min離心20 min，把上清去掉，將MS液體培養(yǎng)基重懸添加進來，劑量為 20 mL，并加入 100μL AS（20 mg/mL），待轉(zhuǎn)染時候用。在無菌環(huán)境中，剪裁香梨葉片，使其變成方形，尺寸為 0.5 cm×0.5 cm，且在已經(jīng)制備好的菌液內(nèi)將其置入，進行10 min的搖晃，90 r/min。平鋪香梨葉片于共培養(yǎng)培養(yǎng)基1/2 MS+TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L培養(yǎng)（25℃，2 d）。隨后轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基 1/2 MS+TDZ1.0mg/L+IBA 0.5mg/L+Kana50mg/L+Cef 400 mg/L培養(yǎng)（光周期16 h/8 h，光強 3000 lx，溫度 25℃）中對愈傷組織和不定芽進行引誘。在7天時對侵染葉片進行GUS染色，把 GUS染液 37℃預(yù)熱，于染色板每孔中加入 1 mL，取侵染的葉片及未轉(zhuǎn)化香梨植株（CK）的葉片，浸入 GUS染液，染色 24 h。在37℃恒溫箱內(nèi)放入染色板，使其密封不可見光。而后以 75%乙醇溶液對樣品進行漂洗，使葉綠素全部脫除并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 SFBB-γ 基因 F-box區(qū)和可變區(qū)V3 ihpRNA的構(gòu)建

PCR 擴增片段（其中141 bp和120 bp分別為F-box區(qū)和 V3區(qū)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的臂，其余的為由引物的‘重疊’部分構(gòu)成的鄰近片段的一些序列）和間隔片段（242 bp，發(fā)卡結(jié)構(gòu)的環(huán)），如圖1A 和圖2A所示。

圖1 Fox區(qū)正、反向和間隔片段的擴增與融合PCRFig.1 The Fox PCR amplification of Sense，antisense，interval fragment and fusion PCR

圖2 可變V3區(qū)正、反向和間隔片段的擴增與融合PCRFig.2 The V3 PCR amplification of Sense，antisense，interval fragment and fusion PCR

回收濃縮后進行第二輪 PCR，得到的最大片段即為 SFBB-γ基因的 RNAi構(gòu)件，其片段大小為524 bp(F-box 區(qū))和 482 bp（V3區(qū)），如圖 1B和圖2B所示，PCR產(chǎn)物還包含有非重組結(jié)構(gòu)片段（300 bp以下），只回收重組結(jié)構(gòu)（最大的片段）并與PMD19-T載體連接，對陽性克隆進行測序，測序結(jié)果如圖 1C和圖 2C，表明片段融合成功。重組質(zhì)粒為PMD19-RNAi-SFBB-F-box和PMD19-RNAi-SFBB-V3。

2.2 SFBB-γ基因F-box區(qū)和可變區(qū)V3 RNAi表達載體構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒 PMD19-RNAi-SFBB經(jīng) PstI和 KpnI酶切后回收小片段（含 ihpRNA結(jié)構(gòu)），載體質(zhì)粒PMD19-T經(jīng) PstI和 KpnI酶切后回收大片段，在T4DNA連接酶的作用下，將 RNAi構(gòu)件連接到植物表達載體上，構(gòu)建 SFBB-γ 基因 RNAi植物表達載體 pCAMBIA1304（圖 3）。

用 PstI和 Kpn I酶切進行驗證，分別得到約12700 bp和 500 bp左右（含發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列）的片段（圖 4A），表明 SFBB-γ 基因的 ihpRNA 片段已經(jīng)成功連接到表達載體上。

圖3 RNAi表達載體示意圖Fig.3 pCAMBIA 1304-RNAi-SFBB vector map

2.3 農(nóng)桿菌中 SFBB-γ 基因 RNAi表達載體的菌液 PCR鑒定

液氮凍融法將 pCAMBIA1304-RNAi-SFBB轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌 GV3101感受態(tài)細胞，在含上述 2種抗生素（Km 和 Sm）的 YEB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取陽性菌落培養(yǎng)，用 FbP1和 FbP6；V3P1和V3P6分別進行菌液 PCR擴增驗證，得到與預(yù)期大小相符的片段（圖4B），測序結(jié)果也與克隆載體上的 ihpRNA結(jié)構(gòu)序列一致，證明表達載體已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101中。

圖4 酶切鑒定及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液PCR驗證Fig.4 Restriction identification and A.tumefaciens bacteria liquid PCR verification

2.4 葉盤轉(zhuǎn)化法驗證

選取未經(jīng)過侵染的香梨無菌葉片（CK）和侵染的庫爾勒香梨無菌苗再生苗的葉片進行GUS組織化學(xué)染色。酒精將其完全脫色后，觀察染色情況，發(fā)現(xiàn)葉片的切傷口處和葉脈處有GUS染液的特異藍色（圖 5、圖 6），說明 SFBB 基因的 F-box區(qū)和可變區(qū)V3 RNAi表達載體基因已經(jīng)成功整合到了庫爾勒香梨無菌苗基因組上，并且能夠表達。

圖5 SFBB-F-box區(qū)RNAi庫爾勒香梨無菌苗轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性檢測Fig.5 GUS activity detection of SFBB-F-box region RNAi transgenic tobacco

圖6 SFBB-V3基因RNAi庫爾勒香梨無菌苗轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性檢測Fig.6 GUS activity detection of SFBB-V3 gene RNAi transgenic tobacco

3 討論

在以融合原理為根基對ihpRNA結(jié)構(gòu)進行建立的時候，基因自身的內(nèi)含子序列（模板為 DNA）發(fā)揮著主要的功效[19-21]。內(nèi)含子區(qū)不存在于本課題組所得到的SFBB-γ基因片段之內(nèi)，所選棉花基因組DNA片段系陸地棉J14基因組A03亞基因組GhHSD1（11-β-hydroxysteroid dehydrogenase ，11-β-羥基類固醇脫氫酶）基因的內(nèi)含子序列（81933396-81933638，242 bp），在剖析比較序列后發(fā)現(xiàn)，棉花序列和已知梨的基因序列的源頭有異，因而可視作發(fā)卡結(jié)構(gòu)的間隔區(qū)[22]。本次研究活動是以不存在內(nèi)含子為前提而開展的，完成了3個片段的融合，且順利建成了發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

與其余物種相比較，梨的遺傳轉(zhuǎn)化研究所獲取的突破性成果較少，并且遺傳轉(zhuǎn)化成效偏低。由于其難以再生，加之基因型的不一樣也會造成比較大的區(qū)別，再開展多項操作譬如侵染、篩養(yǎng)等之后，再生不定芽的概率更低。在轉(zhuǎn)化完成后，多數(shù)果樹（尤其是木本果樹）難以獲得轉(zhuǎn)基因植株，無法進行后續(xù)的基因功能研究，多數(shù)研究多停滯或仍在此階段摸索。轉(zhuǎn)基因的成功與否受到多個條件的影響，其中多數(shù)研究者認為最重要的因素是：菌株的侵染力和植物材料的類型、生理狀態(tài)。由于外植體的生理狀態(tài)會影響葉片再生率，同時對農(nóng)桿菌會呈現(xiàn)不同的耐受力，所以研究中采用葉盤轉(zhuǎn)化法時，選取的是試管苗上部完全展開的健壯葉片作受體，推測其擁有更高的再生能力。但本試驗僅獲得葉片 GUS染色結(jié)果并未獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，推測可能是由于用 GV3101做菌株，孟更[22]提出在梨的遺傳轉(zhuǎn)化試驗中用 GV3101做菌株轉(zhuǎn)化率幾乎為零，未得到想要的結(jié)果。所以獲得轉(zhuǎn)基因再生植株是本試驗室下一步工作重點之一。

4 結(jié)論

已知庫爾勒香梨自交不親和SFBB-γ基因cDNA全長序列是本次研究活動開展的前提，利用融合PCR分別構(gòu)建臂長141 bp、莖環(huán)253 bp的SFBB-γ基因的F-box區(qū)的ihpRNA結(jié)構(gòu)和臂長120 bp、莖環(huán)253 bp的SFBB-γ 基因的可變區(qū) V3的ihpRNA結(jié)構(gòu)，結(jié)合酶切連接成功構(gòu)建 SFBB基因的F-box區(qū)和可變區(qū)V3兩個區(qū)域的RNAi表達載體。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明，庫爾勒香梨無菌苗葉片切傷處以及葉脈處有特異藍色，說明SFBB基因的F-box區(qū)和可變區(qū)V3目的基因已成功轉(zhuǎn)化到庫爾勒香梨無菌苗的基因組中并且能夠表達。為誘導(dǎo)香梨 SFBB-γ基因轉(zhuǎn)錄后基因沉默、獲得自交親和的梨提供參考。