基于基因表達(dá)譜芯片雜交分析Lamprey-PHB2轉(zhuǎn)染前后Chang liver細(xì)胞的基因表達(dá)差異

時(shí) 穎, 李 晴, 郭思呈, 李慶偉*, 李鐵松*

(1.遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 七鰓鰻研究中心,遼寧 大連 116081; 2.大連市第十二中學(xué),遼寧 大連 116081)

七鰓鰻(Lampetrajaponica)隸屬于圓口綱(Cyclostomata)七鰓鰻目(Petromyzonidae).廣泛分布于寒、溫帶的淡水河近海水域,包括非寄生、淡水寄生及洄游寄生種類[1].七鰓鰻是已知最古老的現(xiàn)存于世的脊椎動(dòng)物,在三十多億年前就已出現(xiàn),在系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中幾乎沒(méi)有形態(tài)上的變化,故有活化石之稱.七鰓鰻作為聯(lián)系無(wú)脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物之間的重要橋梁,反應(yīng)了無(wú)脊椎動(dòng)物的進(jìn)化史.同時(shí),作為脊椎動(dòng)物最直接的祖先,七鰓鰻又是脊椎動(dòng)物演化發(fā)育生物學(xué)研究的重要模式生物[2].

抗增殖蛋白2 (PHB2) 是PHB家族中的一員,是一種結(jié)構(gòu)高度保守,分布廣泛的膜蛋白,同時(shí)它也是一種多功能蛋白質(zhì),參與細(xì)胞的多種生命活動(dòng)[3],最初作為與鼠B淋巴細(xì)胞的IgM受體相互作用的蛋白而被發(fā)現(xiàn)[4].人PHB2基因位于常染色體 12p13上,其全長(zhǎng) cDNA序列共有900個(gè)堿基對(duì),編碼中含299個(gè)氨基酸殘基的PHB2蛋白,具有高度的保守性,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)保守的PHB結(jié)構(gòu)域[5].PHB 家族包括PHB1和PHB2兩種亞型,人PHB1位于染色體17q21上,長(zhǎng)11 kb.PHB1和PHB2蛋白以異源二聚體形式存在,12～16對(duì)異源二聚體聚合成直徑約為20～25 nm的花環(huán)柵欄狀的復(fù)合體,維持線粒體形態(tài)的穩(wěn)定[6].

七鰓鰻(Lm)-PHB2與人PHB2氨基酸序列一致性較高,在PHB結(jié)構(gòu)域處,兩者的氨基酸序列極為相似,而在N-端和C-端,兩者的氨基酸序列存在顯著的差異.其3′端序列含有豐富的信息量,基因的3′非翻譯區(qū)涉及了基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控過(guò)程,主要參與調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性及降解速率、翻譯時(shí)間和位點(diǎn)、控制翻譯起始及效率[7-8].PHB2的C-端無(wú)規(guī)則卷曲部位具有ERα的作用位點(diǎn)[9],3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)是發(fā)揮抗增殖作用的部位[10].李鐵松等[11]發(fā)現(xiàn)Lm-PHB2 的N-端具有信號(hào)肽,這可能是決定Lm-PHB2在細(xì)胞中定位遷移的因素.基因的5′UTR序列還參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),但其機(jī)制尚不明確.本文作者利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)分析Lm-PHB2的過(guò)表達(dá)對(duì)張氏肝(CHL)細(xì)胞中基因表達(dá)差異的影響,為PHB2作為藥物靶點(diǎn)治療人類疾病提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CHL細(xì)胞、pEGFP-N1、pEGFP-N1-PHB2菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Trizol試劑購(gòu)自GIBCO BRL;磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、胎牛血清、Hyclone1640培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自大連晨鈺有限公司;Translipid Transfection Reagent Kit購(gòu)自北京TransGen Biotech公司.基因表達(dá)譜芯片由上海伯豪技術(shù)有限公司合成.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)所用引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成,其序列如表1所示.

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物的序列

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CHL細(xì)胞培養(yǎng)

CHL細(xì)胞自液氮中復(fù)蘇,在37 ℃ 的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)基選用含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))雙抗的1640培養(yǎng)基.每天更換1次培養(yǎng)基.當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí),用0.25%(體積分?jǐn)?shù))的胰酶進(jìn)行消化傳代,復(fù)蘇后的CHL細(xì)胞經(jīng)3次傳代后用于實(shí)驗(yàn)研究.

1.2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

將CHL細(xì)胞接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中,待CHL細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí),按照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染.取pEGFP-N1和pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒DNA 各8 μg分別溶于500 μL 1640培養(yǎng)基中,另取2個(gè)tube管分別加入500 μL 1640培養(yǎng)基和20 μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體.待充分溶解后,將稀釋后的脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA混合20 min,然后分別加入培養(yǎng)皿中,轉(zhuǎn)染后放入37 ℃的 CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)4～6 h后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率.

1.2.3 RNA提取

圖1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后CHL細(xì)胞.(a) pEGFP-N1,明場(chǎng);(b) pEGFP-N1-Lm-PHB2明場(chǎng);(c) pEGFP-N1 暗場(chǎng);(d) pEGFP-N1-Lm-PHB2暗場(chǎng)

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的CHL細(xì)胞(圖1)用PBS清洗1次,采用傳統(tǒng)方法提取RNA,經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳后,可清晰見(jiàn)到18S、28S及5S條帶,無(wú)蛋白質(zhì)和基因組污染.測(cè)得光密度(OD)值A(chǔ)260/A280均在1.8～2.0之間,說(shuō)明提取的RNA符合實(shí)驗(yàn)要求,按說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)成cDNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)

使用TaKaRa的SYBR PrimeScript RT-PCR Kit 和AB Life Technologies 7500 PCR儀進(jìn)行檢測(cè).以glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)作為內(nèi)參,PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均按說(shuō)明書(shū).所有反應(yīng)均重復(fù)3次,最終測(cè)出各基因的表達(dá)水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 Lm-PHB2與其他物種氨基酸序列一致性的比較

從NCBI Protein數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇了其他10個(gè)物種的PHB2與Lm-PHB2一起進(jìn)行進(jìn)化分析,各物種與東北七鰓鰻的序列一致性如表2所示.由表2可知,從低等的釀酒酵母到高等動(dòng)物人的PHB2與Lm-PHB2之間都具有高度的序列一致性,這表明PHB2是一種高度保守的,在遺傳進(jìn)化中必不可少的蛋白.

表2 其他物種與Lm-PHB2的氨基酸序列一致性比較

2.2 Lm-PHB2與人PHB2的氨基酸序列排布

為了檢測(cè)Lm-PHB2與人PHB2氨基酸序列的一致性,使用 Bioedit 7.0 軟件對(duì) Lm-PHB2和人PHB2氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì),結(jié)果如圖2所示.由圖2可知,二者序列一致性高達(dá)80%,且在PHB結(jié)構(gòu)域二者的一致性極高,而N-端和C-端的序列一致性較低.這約20%的序列差異表明二者仍可能有許多功能上的差異,且這種差異是由N-端或C-端導(dǎo)致,因此利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)Lm-PHB2轉(zhuǎn)染后CHL細(xì)胞的基因表達(dá)差異進(jìn)行分析.

圖2 Lm-PHB2與人PHB2的氨基酸序列排布

2.3 RNA提取、基因表達(dá)譜芯片圖像采集與數(shù)據(jù)分析

對(duì)基因芯片雜交陣列中提取出的雜交點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行定量分析和標(biāo)準(zhǔn)化處理.結(jié)果表明,按照差異倍數(shù)為3的標(biāo)準(zhǔn),以轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒的CHL細(xì)胞為對(duì)照,在轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒后的CHL細(xì)胞中共有270條基因表達(dá)差異顯著,其中上調(diào)的基因有141條,下調(diào)的基因有129條.

基因本體(GO)在生物信息學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用.通過(guò)將差異基因做 GO 富集分析,可以把基因按照不同的功能進(jìn)行歸類,達(dá)到對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類的目的.采取的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為Fisher精確檢驗(yàn),挑選的標(biāo)準(zhǔn)是落在某個(gè)term/pathway上的差異基因數(shù)目不小于4,p<0.05(顯著差異).圖3中,取得的 term/pathway按照enrich factor的值從大小降序排列,取前 30 個(gè)結(jié)果.Enrich factor 定義為:某個(gè)term中的差異基因數(shù)目與總的差異基因數(shù)目之比除以數(shù)據(jù)庫(kù)term中總的基因數(shù)目與數(shù)據(jù)庫(kù)中總的基因數(shù)目之比.由圖3可知,與對(duì)照組相比,當(dāng)CHL細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒后有大量的基因表達(dá)差異,這些基因涵蓋了分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)功能.在分子功能方面,電壓-封閉的鉀離子通道的活性和氧結(jié)合活性相關(guān)基因的表達(dá)受影響較為顯著;在細(xì)胞組分方面,相關(guān)基因的表達(dá)受影響偏小,只有反式高爾基體膜和分泌顆粒膜相關(guān)基因受影響顯著;在關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程中,相關(guān)基因的表達(dá)受影響最為顯著,包括他汀類蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化、Stat3蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的正調(diào)控,肽酪氨酸磷酸化的正調(diào)控,其他有機(jī)體的細(xì)胞殺傷和細(xì)胞因子的產(chǎn)生與免疫反應(yīng)都受到顯著的影響.

KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù),它有助于把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究.KEGG提供了所有可能的代謝途徑,包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝,及有機(jī)物的生物降解,其采用的分析方式與GO分析一樣.KEGG結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,當(dāng)CHL細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒后有大量的信號(hào)通路受影響,其中5條信號(hào)通路中相關(guān)基因的變化極顯著,分別是蛋白消化和吸收信號(hào)通路、嘌呤代謝信號(hào)通路、細(xì)胞因子間受體的相互作用、煙酸和煙酰胺代謝途徑和嗅覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)通路(圖4).這表明Lm-PHB2在人正常細(xì)胞中發(fā)揮重要功能.

圖3 GO富集分析

圖4 KEGG富集分析

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)驗(yàn)證

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒的CHL細(xì)胞中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化進(jìn)行檢測(cè)(CHL細(xì)胞轉(zhuǎn)染后如圖5所示).結(jié)果表明,在氧化應(yīng)激信號(hào)通路中過(guò)氧化氫酶(CAT)和人PHB2表達(dá)顯著上調(diào),而谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)表達(dá)顯著下調(diào),超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá)略微上調(diào);在細(xì)胞周期信號(hào)通路中細(xì)胞周期蛋白25同源蛋白C(CDC25C)表達(dá)顯著下調(diào),細(xì)胞周期蛋白A2(Cyclin A2)的表達(dá)沒(méi)有顯著變化;在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中HAX1(haematopoietic cell specific protein 1-associated protein X-1)的表達(dá)量顯著降低.這一結(jié)果與基因表達(dá)譜芯片的結(jié)果一致.

圖5 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒與pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒后相關(guān)基因的表達(dá)差異.以轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒為對(duì)照組,*p<0.05,**p< 0.01

3 討 論

對(duì)課題組前期從東北七鰓鰻中克隆出的PHB2(Lm-PHB2)與10個(gè)物種進(jìn)行了同源序列比較,結(jié)果顯示,PHB2在高等脊椎動(dòng)物和低等動(dòng)物中存在高度的保守性.Lm-PHB2與人PHB2基因序列一致性較高,這說(shuō)明Lm-PHB2已經(jīng)具備高等脊椎動(dòng)物PHB2的基本結(jié)構(gòu)特征,但二者氨基酸C-端和N-端序列的差異提示Lm-PHB2可能存在人PHB2所不具有的特殊功能,因此,后續(xù)通過(guò)基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行驗(yàn)證.

基因表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,按照差異倍數(shù)大于3倍的標(biāo)準(zhǔn),以轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒為對(duì)照,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2后CHL細(xì)胞中共有270條顯著差異表達(dá)基因;KEGG富集分析和GO富集分析結(jié)果顯示,Lm-PHB2對(duì)CHL細(xì)胞的影響涵蓋信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、抗氧化活性等多種信號(hào)通路,這說(shuō)明Lm-PHB2在CHL細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用并且作用極為廣泛,有待于繼續(xù)深入研究.

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)CHL細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2后氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè).結(jié)果顯示,在氧化應(yīng)激信號(hào)通路中,CAT和內(nèi)源性PHB2表達(dá)顯著上調(diào),GST表達(dá)顯著下調(diào),而SOD的表達(dá)有略微上調(diào).SOD和CAT是生物體抗氧化酶系統(tǒng)中2種重要的酶類,可以及時(shí)清除活性氧自由基,保護(hù)細(xì)胞成分的結(jié)構(gòu)和功能[12-13].當(dāng)在CHL細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Lm-PHB2時(shí),CAT與SOD表達(dá)上調(diào),二者共同參與抗氧化應(yīng)激反應(yīng).GST具有消除體內(nèi)過(guò)氧化物及解毒的雙重功能,可催化谷胱甘肽GSH與中間代謝物的結(jié)合,成為水溶性化合物排出體外,起到解毒的作用[14].GST基因的表達(dá)下調(diào)說(shuō)明Lm-PHB2在CHL細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性.CDC25C是控制細(xì)胞周期進(jìn)入M期的關(guān)鍵蛋白之一,通過(guò)激活Cyclin B1/CDC2促進(jìn)細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期[15-16],其表達(dá)下調(diào)說(shuō)明Lm-PHB2可能參與了細(xì)胞周期調(diào)控.HAX1是抗細(xì)胞凋亡蛋白,可以與細(xì)胞內(nèi)多種凋亡相關(guān)蛋白如caspase 9,Parl和Omi/HtrA2 等相互作用[17],在調(diào)控凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮作用,其表達(dá)量的顯著下調(diào)說(shuō)明Lm-PHB2可能參與細(xì)胞凋亡調(diào)控,并且Lm-PHB2的異常表達(dá)并沒(méi)有促使CHL細(xì)胞凋亡.以上結(jié)果表明Lm-PHB2可能在抗氧化應(yīng)激耐受性、細(xì)胞周期調(diào)控和抑制細(xì)胞凋亡中都發(fā)揮重要作用,但其中的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究.

4 結(jié) 論

選取了10個(gè)物種與本課題組前期克隆得到的東北七鰓鰻PHB2(Lm-PHB2)進(jìn)行氨基酸序列相似性對(duì)比,結(jié)果表明各物種的PHB2氨基酸序列在PHB結(jié)構(gòu)域處高度保守,但在N-端和C-端氨基酸序列保守性較低.利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)分析了將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Lm-PHB2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入CHL細(xì)胞后基因的表達(dá)差異,結(jié)果顯示CHL細(xì)胞中共有270條顯著差異表達(dá)基因,其中顯著上調(diào)基因共141條,顯著下調(diào)基因共129條,涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝和細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)基因表達(dá)譜芯片分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒后CDC25C、氧化應(yīng)激相關(guān)基因(CAT、SOD、GST)和抗細(xì)胞凋亡基因(HAX1)均有顯著性差異.