接骨續(xù)筋丸微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)

王 威，朱慶麗，朱殿雨 ，李倚云*

(1.揚(yáng)州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，揚(yáng)州 225009； 2.揚(yáng)州寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院，揚(yáng)州 225800)

接骨續(xù)筋丸具有和營(yíng)活血、接骨續(xù)筋作用，用于跌打損傷所致軟組織損傷、骨折脫位中后期筋肉攣痛見(jiàn)上述癥候者，是臨床使用近10年的一種醫(yī)院中藥制劑，主要由紅花、血竭、麝香、骨碎補(bǔ)等15味藥材炮制而成。方中紅花、血竭[1，2]具有活血行滯、化瘀生新作用為君藥；麝香、丁香[3，4]有補(bǔ)腎助陽(yáng)、活血通經(jīng)作用為臣藥；骨碎補(bǔ)、自然銅[5，6]等具接骨續(xù)斷作用，全方合用可續(xù)筋接骨、消腫止痛。微生物限度檢查是考查口服固體制劑療效及安全性的一個(gè)重要項(xiàng)目。為了保證該制劑的使用安全性，真實(shí)反映該制劑的微生物污染狀況，根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1105、1106、1107[7]的規(guī)定及要求，進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，建立微生物限度檢查法。

接骨續(xù)筋丸為含有藥材原粉的中藥制劑，根據(jù)《中國(guó)藥典》通則1107，微生物限度檢查包括需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)和控制菌(大腸埃希菌、沙門(mén)菌和耐膽鹽革蘭陰性菌)檢查。需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)要求試驗(yàn)菌的菌數(shù)回收率在0.5～2，控制菌檢查要求陽(yáng)性對(duì)照組中檢出相應(yīng)的對(duì)照菌[7]。在建立檢查方法過(guò)程中，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)上其他類(lèi)型菌落的生長(zhǎng)造成霉菌和酵母菌總數(shù)超出限度規(guī)定，干擾了結(jié)果判斷，本文同時(shí)就此情況進(jìn)行試驗(yàn)研究，建立更合理的檢查法，真實(shí)反映該制劑的微生物染菌程度，有助于切實(shí)掌握該醫(yī)院制劑質(zhì)量，把控好制劑生產(chǎn)環(huán)節(jié)，為患者及時(shí)提供合格產(chǎn)品。

1 材料及儀器

1.1儀器 SZ-201凈化工作臺(tái)(安徽蚌埠凈化設(shè)備廠)、BHC-850生物安全柜(吳江市凈化設(shè)備總廠)、GR85DA高壓蒸汽滅菌器[致微(廈門(mén))儀器有限公司]、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱和MJX-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)、HKG-9220A電熱恒溫干燥箱(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、SE602F電子天平(奧豪斯儀器有限公司)、XSP-BM-2C生物顯微鏡(上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司)。

1.2供試品 接骨續(xù)筋丸(規(guī)格：45 g/瓶，揚(yáng)州寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院，批號(hào)170612、170626、170701)。

1.3試驗(yàn)用菌株 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candidaalbican)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]、大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、乙型副傷寒沙門(mén)菌(SalmonellaparatyphiB)[CMCC(B)50094]均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4培養(yǎng)基及試劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號(hào)20161206)、SDA(批號(hào)20150923)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，批號(hào)20160719)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB，批號(hào)20150722)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)20150819)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(批號(hào)20150715)、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(TSI，批號(hào)20150917)、pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液(批號(hào)20160723)均由青島海博生物技術(shù)有限公司提供；麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào)20151109)、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG，批號(hào)20160501)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)20151106)、RV沙門(mén)增菌液體培養(yǎng)基(批號(hào)20151101)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(XLD，批號(hào)20160501)均由北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司提供；硫酸慶大霉素注射液[規(guī)格：2 ml∶80 mg(8萬(wàn)單位)，批號(hào)3170609]，由福安藥業(yè)集團(tuán)煙臺(tái)只楚藥業(yè)有限公司提供。SDA對(duì)照培養(yǎng)基(SDARM，批號(hào)135013-201502)，來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，由江蘇省康華醫(yī)藥科技實(shí)業(yè)中心提供；0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液及革蘭氏染色試液為實(shí)驗(yàn)室自配。

2 方法與結(jié)果

參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1105、1106、1107微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)要求，建立檢查法。

2.1菌液制備 取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌新鮮TSB培養(yǎng)物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋為小于104cfu/ml(計(jì)數(shù)方法適用性)或小于100 cfu/ml(控制菌檢查方法適用性)的菌懸液。取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌新鮮SDB培養(yǎng)物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋為小于104cfu/ml的菌懸液。取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁斜面培養(yǎng)物，加適量含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗下孢子，并稀釋為小于104cfu/ml的孢子懸液。

2.2供試液制備 取供試品10 g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 ml，勻漿儀3 000 r/min處理30 s，使分散均勻，作為1∶10供試液，取1∶10供試液10 ml，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 ml，作為1∶100供試液。取供試品10 g，加TSB至100 ml，充分振搖使分散均勻，作為耐膽鹽革蘭陰性菌檢查初步增菌液；另取供試品10 g，研磨后接種至200 ml TSB中，作為沙門(mén)菌檢查初步增菌培養(yǎng)液。

2.3需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 接骨續(xù)筋丸中無(wú)明顯抑菌成分，初步采用傾注平皿法(1 ml/皿)，使用TSA對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉為需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)代表菌進(jìn)行回收試驗(yàn)。

2.3.1試驗(yàn)組 取1∶100供試液50 ml 5份，分別加入各試驗(yàn)菌懸液0.5 ml，混勻。分別取各組試液1 ml，置90 mm無(wú)菌平皿中，注入15～20 ml溫度不超過(guò)45 ℃熔化的TSA，混勻，凝固，35 ℃倒置培養(yǎng)，作為需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)組。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)3 d，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)5 d。每組平行操作2平皿。

2.3.2供試品對(duì)照組 取1∶100供試液50 ml，加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液0.5 ml，混勻。不加各試驗(yàn)菌，操作同“2.3.1”，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

2.3.3菌液對(duì)照組 取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液50 ml 5份，分別加入各試驗(yàn)菌懸液0.5 ml，混勻。操作同“2.3.1”，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。試驗(yàn)菌菌數(shù)回收率=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)。

2.3.4試驗(yàn)結(jié)果 由表1可知，各試驗(yàn)菌菌數(shù)回收率均在0.5～2范圍內(nèi)，所采用的方法適用于該制劑的需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查。

2.4霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.4.1試驗(yàn)方法Ⅰ 取1∶10供試液，采用傾注平皿法(1 ml/皿)，使用SDA，以黑曲霉、白色念珠菌為霉菌和酵母菌為代表菌進(jìn)行回收試驗(yàn)。試驗(yàn)操作同“2.3.1”～“2.3.3”，25 ℃倒置培養(yǎng)5 d，分別計(jì)數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.2試驗(yàn)方法Ⅱ 取1∶10供試液，采用含慶大霉素的SDA，抑制供試品中細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，試驗(yàn)操作同“2.4.1”。SDA在臨用前，加入慶大霉素濃度為5 000 U/L。另外使用SDARM，對(duì)菌液對(duì)照組進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.3試驗(yàn)結(jié)果 由表2和表3可以看出，方法Ⅰ和Ⅱ試驗(yàn)組2株試驗(yàn)菌菌數(shù)回收率均在0.5～2，符合方法適用性試驗(yàn)要求。但根據(jù)《中國(guó)藥典》四部通則1107限度標(biāo)準(zhǔn)，供試品霉菌和酵母菌總數(shù)限度為102cfu/g，方法Ⅰ結(jié)果3個(gè)批號(hào)的供試品霉菌和酵母菌總數(shù)分別為420、490和380 cfu/g，均超過(guò)此限度，樣品該項(xiàng)目不符合要求。由表3可以看出，含有慶大霉素的SDA均有效抑制了供試品中的非霉菌和酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，使供試品對(duì)照組的“霉菌和酵母菌總數(shù)”明顯減少，排除了干擾。對(duì)“2.4.1”中供試品對(duì)照組的菌落進(jìn)行形態(tài)和革蘭氏染色觀察，基本屬于細(xì)菌，使用含慶大霉素5 000 U/L的濃度的SDA可有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。另外含有慶大霉素的SDA對(duì)于霉菌和酵母菌的促生長(zhǎng)能力與SDARM比較無(wú)差異，符合培養(yǎng)基適用性檢查要求[7]。

表1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

表2 霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)方法Ⅰ結(jié)果

表3 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)方法Ⅱ結(jié)果

2.5控制菌檢查適用性試驗(yàn)

2.5.1大腸埃希菌 取1∶10供試液10 ml，接種至100 ml TSB中，加入大腸埃希菌菌懸液1 ml作為大腸埃希菌檢查陽(yáng)性對(duì)照組；同法操作不加入陽(yáng)性菌，作為供試品組；同時(shí)取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液10 ml接種至100 ml TSB中，作為陰性對(duì)照組。取上述各組，按《中國(guó)藥典》規(guī)定的過(guò)程，分別進(jìn)行增菌培養(yǎng)、麥康凱液體培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板選擇和分離培養(yǎng)。結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照組中檢出大腸埃希菌。

2.5.2耐膽鹽革蘭陰性菌 取“2.2”項(xiàng)下的耐膽鹽革蘭陰性菌檢查初步增菌培養(yǎng)液3份，1份加入大腸埃希菌菌懸液1 ml、1份加入銅綠假單胞菌菌懸液1 ml作為陽(yáng)性對(duì)照組，1份作為供試品組；同時(shí)取TSB 200 ml作為陰性對(duì)照組，按《中國(guó)藥典》規(guī)定的過(guò)程，分別進(jìn)行增菌培養(yǎng)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基和紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板選擇和分離培養(yǎng)。結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照組中檢出以大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為代表的耐膽鹽革蘭陰性菌。

2.5.3沙門(mén)菌 取“2.2”項(xiàng)下的沙門(mén)菌檢查初步增菌培養(yǎng)液2份，1份加入沙門(mén)菌菌懸液1 ml作為陽(yáng)性對(duì)照組，另一份作為供試品組；同時(shí)取TSB 200 ml作為陰性對(duì)照組，按《中國(guó)藥典》規(guī)定的過(guò)程，分別進(jìn)行增菌培養(yǎng)、RV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基和XLD平板選擇和分離培養(yǎng)。結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照組中檢出沙門(mén)菌。

3 討論

3.1接骨續(xù)筋丸微生物計(jì)數(shù)采用傾注平皿法(1 ml/皿)，需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的5株菌株及使用含慶大霉素(5 000 U/L)的SDA進(jìn)行霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的2株菌株的菌數(shù)回收率均在0.5～2之間，控制菌檢查采用的方法在陽(yáng)性對(duì)照組中檢出了大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門(mén)菌，所建立的方法適用于該制劑的微生物限度檢查。

3.2《中國(guó)藥典》2015年版微生物限度檢查中計(jì)數(shù)法的適用范圍較舊版發(fā)生了變化[8]，TSA和SDA提升了微生物的促生長(zhǎng)能力，擴(kuò)大了計(jì)數(shù)微生物的類(lèi)型和范圍[9，10]，供試品的霉菌和酵母菌總數(shù)為SDA上生長(zhǎng)的總菌落。接骨續(xù)筋丸的霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用“2.4.1”項(xiàng)下方法，方法符合適用性試驗(yàn)要求，因非目的菌的生長(zhǎng)導(dǎo)致超出限度標(biāo)準(zhǔn)，制劑的產(chǎn)品質(zhì)量“不合格”。在本次研究中，重新建立微生物限度檢查法，使用添加適量慶大霉素的SDA，抑制了非目的菌的生長(zhǎng)，體現(xiàn)產(chǎn)品霉菌和酵母菌的真實(shí)污染狀況，避免了假陽(yáng)性結(jié)果。

3.3非無(wú)菌口服固體制劑在微生物限度檢查中，同樣存在非目的菌的生長(zhǎng)致使霉菌和酵母菌總數(shù)不符合限度標(biāo)準(zhǔn)的情況，尤其是含藥材原粉的片劑、膠囊、丸劑[11]等中成藥，因?yàn)樵o料、生產(chǎn)及炮制工藝、包裝、儲(chǔ)藏和給藥途徑等原因，這些制劑允許高濃度的需氧菌存在，一般都在104cfu/g以上，其容易在普通SDA上生長(zhǎng)，造成霉菌和酵母菌總數(shù)超出限度。使用添加適量抗生素如慶大霉素、氯霉素等SDA[12]或其他選擇性培養(yǎng)基建立檢查方法，可以反映產(chǎn)品真實(shí)的霉菌和酵母菌污染狀況，避免假陽(yáng)性結(jié)果。本次試驗(yàn)研究結(jié)合工作實(shí)際，為處理此類(lèi)假陽(yáng)性情況提供思路。