金黃色葡萄球菌定量質控菌株的制備及其在檢驗工作中的應用

解 慧

(天津市藥品檢驗研究院，天津 300070)

實驗室數(shù)據(jù)可靠性和有效性是檢驗工作和科學研究的生命線。利用微生物標準菌株進行檢驗方法學驗證試驗越來越受到重視，繼《中國藥典》要求進行微生物檢驗方法適用性試驗后，保健食品和化妝品風險監(jiān)測工作中也提出相關要求。利用標準菌種作為參考標準物質，進行藥品、保健食品和化妝品微生物檢驗過程控制，是保障檢驗結果科學準確的重要環(huán)節(jié)，《中國藥典》、保健食品和化妝品風險監(jiān)測工作手冊等均有明確要求[1-3]。微生物檢驗方法學適用性試驗需要用到一定數(shù)目的標準菌株，傳統(tǒng)的梯度稀釋方法操作繁瑣，工作量較大。目前，市售國內外質控菌株類型較少，多使用ATCC菌株或《中國藥典》常用菌株，且價格昂貴，使檢驗成本提高。微生物定量質控菌株是考查實驗室檢驗結果準確、可靠的重要工具，適用于食品、藥品微生物檢測的定量質控菌株是制約微生物檢驗標準化的一個瓶頸。

本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和流程，制備金黃色葡萄球菌定量質控菌株，并對其均勻性、穩(wěn)定性和保存條件進行考查，證明其能滿足質控樣品使用的要求，可以用于日常檢驗工作中的陽性對照試驗和微生物限度檢查方法學適用性試驗，還可用于實驗室內質量控制比對試驗。

1 儀器與試藥

1.1儀器 生物安全柜(BAKER SG-403A TX-INT)，天平(sartorius TE612-L)，恒溫培養(yǎng)箱(BINDER KB720)，恒溫搖床(Thermo MaxQ 4000)，冷凍干燥機(HETO POWER DRY LL1500)，低速自動平衡離心機(Eppendof Centrifuge 5702)，冰箱(Hair BCD-268DA)，低溫冰箱(Froilabo Congelateur)。

1.2試藥D-海藻糖(Solarbio，批號411B054)，脫脂奶粉(Solarbio，批號408B0513)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，北京陸橋有限責任公司，批號151027)，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，北京陸橋有限責任公司，批號151202)，磷酸鹽緩沖液 PBS(北京奧博星生物技術有限責任公司，批號20140822)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B) 26 003] 購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1金黃色葡萄球菌的生長曲線測定 將甘油管保存的菌株接種至10 ml TSB培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)18 h，使菌株充分復蘇。吸取0.1 ml培養(yǎng)物接種于新鮮的10 ml TSB培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)過夜，作為種子液。吸取1 ml種子液接種于新鮮的100 ml TSB培養(yǎng)基中，36 ℃、180 r/min培養(yǎng)。每隔2 h，無菌條件下吸取5 ml培養(yǎng)液，于600 nm處測定吸光度，繪制金黃色葡萄球菌的生長曲線。

2.2金黃色葡萄球菌質控菌株的制備流程 按“2.1”步驟制備金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物，4 400 r/min離心5 min，傾倒上清，PBS清洗一次，4 400 r/min再次離心5 min獲得菌體。采用5%脫脂奶粉+5%海藻糖作為保護劑[4]，使菌體充分懸浮混勻。分裝至西林瓶中，-20 ℃預凍4 h，使混懸液冷凍凝結。放入真空冷凍干燥機，待樣品充分干燥后取出。將透氣棉塞更換為無菌橡膠塞，密封冷藏。以此方法制成106cfu含菌量和104cfu含菌量的樣本，冷凍干燥后保存。

2.3離心和清洗損失率的測定 取種子液1 ml接種于新鮮的100 ml TSB培養(yǎng)基中，于搖床中180 r/min、36 ℃培養(yǎng)4 h，此時的混懸液作為樣品1。取部分上述培養(yǎng)物4 400 r/min離心5 min，傾倒上清，PBS清洗一次，4 400 r/min再次離心5 min獲得菌體。采用5%脫脂奶粉+5%海藻糖作為保護劑[4]，使菌體充分懸浮混勻，此時的混懸液作為樣品2。對樣品1和樣品2分別進行梯度稀釋，測定活菌數(shù)，分別記為A和B。則計算公式為：離心和清洗損失率=(1-B/A)×100%。

2.4冷凍干燥損失率的測定 待樣品在冷凍干燥機凍干后，取出，立刻取其中一瓶作為樣品3。梯度稀釋后，測定活菌數(shù)，記為C。則計算公式為：冷凍干燥損失率=(1-C/B)×100%。

2.5金黃色葡萄球菌質控樣品的均一性驗證 106cfu 含菌量樣本均一性驗證：隨機抽取106cfu組質控樣品10瓶，每瓶加入1 ml 生理鹽水，將金黃色葡萄球菌凍干物充分溶解，吸取0.1 ml進行適當梯度稀釋后，取1 ml于平皿中，傾注TSA培養(yǎng)基，置36 ℃培養(yǎng)18～24 h。進行菌落計數(shù)。同法進行104cfu組質控樣品計數(shù)。

2.6儲藏條件的驗證 將制備的106cfu和104cfu金黃色葡萄球菌質控樣品分別保存于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃。于0～90 d及1年分別取出金黃色葡萄球菌質控樣品進行菌落計數(shù)，觀察復蘇率的變化，考查貯藏穩(wěn)定性。

其中R為復現(xiàn)性限，r為重復性限，n為檢測值的數(shù)量。

2.8定量質控菌株的活力檢測 參照《中國藥典》2015版四部通則1105非無菌產品微生物檢查：微生物計數(shù)法，選擇8種藥品，分別采用-80 ℃保存的106cfu樣品和正常制備工作菌株，進行回收率測定。所采用藥品各取10 g，分別加pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，混勻，作為1∶10供試液。具體實驗方法如下。

2.8.1吲達帕胺滴丸 取1∶10供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml至平皿中，立即傾注TSA。

2.8.2脈管康復片 取1∶10供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量<1 000 cfu/ml的供試液，取0.1 ml至平皿中，立即傾注TSA。

2.8.3生脈飲/鹽酸二甲雙胍片 取1∶10供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量<2 000 cfu/ml的供試液，取0.5 ml至平皿中，立即傾注TSA。

2.8.4厄貝沙坦氫氯噻嗪分散片/醒腦安神膠囊 取1∶10供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量<5 000 cfu/ml的供試液，取0.2 ml至平皿中，立即傾注TSA。

2.8.5清咽滴丸 取1∶10供試液0.2 ml用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液100 ml稀釋后，全量薄膜過濾，用500 ml pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分次沖洗5次，在最后一次沖洗液中加入規(guī)定量試驗菌(不大于100 cfu)后薄膜過濾，取膜貼于TSA上，依法檢查。

2.8.6鹽酸沙格雷酯片 將1∶10供試液全量置于帶過濾功能均質器專用袋(上新牌，規(guī)格30 cm×19 cm)大體積一側中，在拍打儀中充分拍打30 s。取粗濾后小體積一側的1∶10供試液0.2 ml薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液500 ml分次沖洗，并在最后一次沖洗液中加入規(guī)定量試驗菌(不大于100 cfu)，取膜貼于TSA上，依法檢查。

3 結果

3.1金黃色葡萄球菌生長曲線 把少量微生物接種到一定體積的新鮮培養(yǎng)基后，在適宜的溫度、通氣等條件下，微生物就會從小到大，數(shù)目增多，表現(xiàn)出有規(guī)律的生長，根據(jù)其生長速率常數(shù)可以得出生長曲線。典型的微生物生長曲線包括延滯期、指數(shù)期(對數(shù)期)、穩(wěn)定期和衰亡期。通過定時取樣，測定600 nm處的吸光度發(fā)現(xiàn)，按1%接種量，180 r/min、36 ℃培養(yǎng)條件下，金黃色葡萄球菌在2 h左右進入對數(shù)期，6 h后進入穩(wěn)定期，此時菌體數(shù)目約為1.0×109cfu(如圖1)。指數(shù)期的微生物代謝活躍，生長迅速，生理特性較一致，各細胞成分平衡增長，因而是代謝、生理研究的好材料。因此采用1%接種量，180 r/min、36 ℃培養(yǎng)4 h，制備金黃色葡萄球菌菌體。

圖1 金黃色葡萄球菌的生長曲線

3.2定量質控菌株的制備 保護劑可以減少冷凍干燥引起的微生物細胞損傷。常見的保護劑包括葡萄糖、谷氨酸等中性或酸性化合物，明膠和藻類等高分子物質及分解物，脫脂乳及血清等天然混合物，及抗壞血酸和羥胺等[6]。脫脂奶粉的主要成分是蛋白質和糖類，其中蛋白質的直徑在1～2 nm之間，溶于水中形成膠體溶液，蛋白質分子比細菌小得多，在菌體外形成蛋白膜，對細胞加以保護，并可固定凍干酶類，防止由于細胞壁蛋白質損壞而引起的胞內物質泄漏，而且脫脂奶粉中其他成分(如乳糖等) 同樣可提高菌體的凍干存活率。海藻糖具有特殊的水合作用，能夠穩(wěn)定細胞膜和蛋白質結構，抗逆保鮮，在冷凍干燥生物制品方面具有廣闊的應用前景。本研究使用5%脫脂奶粉和5%海藻糖作為保護劑，制成106cfu含菌量、104cfu含菌量的凍存管，凍存菌體經活化證明均保持了較好的活性。離心和清洗過程對菌體細胞的損失率較大，約為95%。冷凍干燥過程同樣造成菌體細胞的減少，損失率約為37%。

3.3質控樣品的均一性檢測 復現(xiàn)性臨界差值(CD)=0.38(R取0.45，r取0.25，n取10)[5]。106cfu組10瓶樣品均一性檢測結果如表1顯示，樣品中金黃色葡萄球菌的平均量為4.6×106cfu，那么控制范圍為1.9×106～1.1×106cfu。本實驗10組數(shù)據(jù)均在上述范圍內，質控樣品中金黃色葡萄球菌的均一性可滿足定量需求。104cfu組10瓶樣品均一性檢測結果如表1顯示，樣品中金黃色葡萄球菌的平均量為5.5×104cfu，則控制范圍為1.3 ×105～2.2×104cfu，本實驗所有數(shù)據(jù)均在上述范圍內，質控樣品中金黃色葡萄球菌的均一性可滿足定量需求。

表1 質控樣品的均一性檢測 cfu

3.4儲存條件檢測 106cfu組和104cfu組質控樣品的儲藏穩(wěn)定性檢測結果見表2。根據(jù)統(tǒng)計結果，4 ℃保存的106cfu組樣品隨時間延長，穩(wěn)定性明顯下降，30 d時回收率只能達到51%，60 d的回收率只有15%。說明制備質控樣品不適宜放置于4 ℃保存。放置于-20 ℃和-80 ℃保存的兩組樣品均保持了較好的穩(wěn)定性，說明低溫有助于保持菌體活性，這和微生物菌株定性保存是一樣的。長期的穩(wěn)定性考查，有待試驗進一步研究。

表2 不同溫度下儲存的定量質控菌株的復蘇率

3.5質控樣品的室內復現(xiàn)性檢測 本實驗中采用復現(xiàn)性臨界差值判斷，復現(xiàn)性臨界差值(CD)=0.38(R取0.45，r取0.25，n取13)。106cfu組13瓶樣品均一性檢測結果如表3顯示，樣品中金黃色葡萄球菌的平均量為4.7×106cfu，那么控制范圍為1.9 ×106～1.1×107cfu(相當于本實驗的指定值為6.67，結果控制范圍為6.29～7.05)。本實驗13組數(shù)據(jù)均在上述范圍內，質控樣品中金黃色葡萄球菌的均一性可滿足定量需求。104cfu組13瓶樣品均一性檢測結果如表3顯示，樣品中金黃色葡萄球菌的平均量為5.6×104cfu，則控制范圍為1.3×105～2.3×104cfu(相當于本實驗的指定值為4.75，結果控制范圍為4.37～5.13)。本實驗所有數(shù)據(jù)均在上述范圍內，質控樣品中金黃色葡萄球菌的均一性可滿足定量需求。

表3 質控樣品的室內復現(xiàn)性檢測結果

3.6質控樣品的活力檢查 表4所列的8種樣品涵蓋了常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法處，均為微生物限度檢查常用方法。對三次試驗的回收率進行平均后，列于表4。可以看出，106cfu組與正常工作菌株的回收率沒有明顯區(qū)別，均符合《中國藥典》2015版要求。

表4 質控樣品用于微生物限度計數(shù)方法學驗證試驗

4 討論

按照預先規(guī)定的條件，組織兩個或多個實驗室(工作人員)對相同或類似的物品進行測量或檢測，并對檢測結果進行評價，是有效的實驗室質量控制手段，也是認可機構確認實驗室檢測能力的技術手段[7]。通過參加比對實驗，有助于實驗室(實驗人員)了解自身的檢測水平，證明檢測能力，或者幫助其發(fā)現(xiàn)存在問題并采取有效措施進行糾正。近幾年，通過參加中國食品藥品檢定研究院、中國檢驗檢疫科學研究院、英國政府化學家實驗室(LGC)和英國FEPAS檢測實驗室能力驗證等舉辦的多個能力驗證項目，實驗室檢測水平得到大幅提升。但是針對實驗室內部質量控制，由于缺少微生物定量質控菌株而較難進行。

4.1具有均勻性和穩(wěn)定性的定量質控菌株是進行比對實驗的必要條件。本研究采用對數(shù)生長后期的金黃色葡萄球菌菌株，離心洗滌后獲得菌體，使用5%脫脂奶粉和5%海藻糖作為保護劑，制成106cfu含菌量、104cfu含菌量的凍存管。經計數(shù)培養(yǎng)證明低溫保存的質控樣品具有較好的均一性和穩(wěn)定性。

4.2在2014年舉辦的醫(yī)療器械檢測機構能力驗證和比對實驗中，對于微生物計數(shù)項目的判定原則為：以測試結果的log為結果，指定值為3.83，各實驗室結果在“指定值±0.5log10”(即3.33～4.23)范圍為即為滿意。2013年LGC舉辦的李斯特菌數(shù)計數(shù)能力驗證項目中，根據(jù)公式Z=(x-X)/SDPA(x為參與者結果的log值，X為指定值，SDPA為0.35log10)，∣Z∣≤2為合格結果，那么實驗結果的控制范圍為“指定值±0.7 log 10”。在本實驗的均一性和室內復現(xiàn)性檢測中，均采用復現(xiàn)性臨界差值進行判斷，分別取0.39和0.38，均小于上述控制標準，控制條件更為嚴格。均勻性試驗和室內重復性檢測證明質控樣品符合均一性要求，-20 ℃和-80 ℃保存具有較好穩(wěn)定性。

4.2質控樣品的活力是限制其適用范圍的重要因素?！吨袊幍洹?015版非無菌產品的微生物限度檢查要求將供試液與工作菌株充分混合后，取樣進行培養(yǎng)計數(shù)。如果質控樣品活力較差，與具有抑菌性的樣品混合后，生長就會被抑制，回收率降低。因此，本研究首次使用不同種類的樣品對106cfu組質控樣品進行活力檢驗。分別考查了無明顯抑菌作用和具有不同抑菌效力共8種樣品的回收率試驗，發(fā)現(xiàn)質控樣品組與正常工作菌株的回收率沒有明顯區(qū)別，均符合《中國藥典》2015版要求。這是關于適用于微生物限度檢查方法學適用性試驗的質控樣品的首次報道。