2株雞源芽孢桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

陳永亮， 高 尚， 王彥紅

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221006； 2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

由于耐藥菌的持續(xù)出現(xiàn)與存在，研究者希望能獲得生物的抑菌方法，近年來芽孢桿菌發(fā)展為益生菌，被廣泛應(yīng)用于豬飼養(yǎng)、禽業(yè)及水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)[1]。候選益生菌菌株主要有蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)等[2-3]。2017年6月從江蘇省揚(yáng)州市高郵市某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的散養(yǎng)草雞中分離出2株芽孢桿菌，經(jīng)鑒定1株為短小芽孢桿菌(B.pumilus)，另1株為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，對(duì)2株細(xì)菌的生化特點(diǎn)、耐藥性及其對(duì)其他細(xì)菌的抑制作用等生物學(xué)特性作初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化，待涼至50 ℃左右時(shí)按5%的比例加入無菌綿羊血配成血瓊脂培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中，4 ℃保存?zhèn)溆?。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基購自上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司，腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管和藥敏試紙購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

2017年6月從江蘇省揚(yáng)州市高郵市某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的600只110日齡散養(yǎng)草雞中取2只消瘦的病雞剖殺，主要病變?yōu)楦文[大且有白色斑點(diǎn)，脾腫大，腺胃腫大。取肝、脾、肺等組織器官，按常規(guī)無菌操作接種于血瓊脂平板上，并于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取單菌落分別在麥康凱培養(yǎng)基與血瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察分離菌的生長(zhǎng)狀況和菌落形態(tài)特征。再挑選單個(gè)菌落用革蘭氏染色，并于顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3 MALDI biotyper分析

參照MALDI biotyper分析儀的操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行單個(gè)菌落點(diǎn)樣、晾干，然后加1 μL甲酸混勻、再晾干后進(jìn)機(jī)器MBT(購自德國Bruker公司，型號(hào)microflex)檢測(cè)，采用flex control程序進(jìn)行檢測(cè)[4]。

1.4 16S rRNA基因測(cè)序

挑取單個(gè)菌落加入20 μL的16S-free H2O水中，煮沸，裂解，制備其DNA模板，按照寶生物工程(大連)有限公司的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大小為 500 bp 的目的片段，然后將剩余的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至金斯瑞生物科技公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生化試驗(yàn)

用接種針挑取純化后細(xì)菌的單個(gè)菌落，按常規(guī)方法分別進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、木糖、棉子糖、甘露醇、鼠李糖、果糖、衛(wèi)茅醇、阿拉伯糖等糖或醇類生化發(fā)酵試驗(yàn)，以及甲基紅(MR)、二乙酰(VP)、硫化氫、淀粉水解、硝酸鹽還原、明膠液化、蛋白胨水(吲哚)等試驗(yàn)。另外進(jìn)行耐鹽(7% NaCl)試驗(yàn)檢測(cè)，置37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，所用藥敏紙片包括頭孢三嗪(菌必治)、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西環(huán)素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星和妥布霉素等15種，具體操作步驟為在無菌條件下，挑取純化后的單個(gè)菌落均勻涂布于血瓊脂平板上，取6 mm藥敏紙片貼于平板瓊脂面上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，測(cè)量各抗生素紙片的抑菌圈直徑。

1.7 分離菌對(duì)其他細(xì)菌的抑菌性試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[5-6]采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)，把臨床分離的雞源大腸桿菌、雞源金黃色葡萄球菌和雞白痢沙門菌分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)72 h，取100 mL菌液以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清液，將下部沉淀用生理鹽水稀釋成1×108CFU/mL的菌懸液，其中雞源大腸桿菌和雞源金黃色葡萄球菌懸液均勻涂布在厚度約為4 mm的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，雞白痢沙門菌懸液均勻涂布在厚度約為4 mm的血平板上，然后在平板上打直徑約為4 mm的孔，封底。用相同方法制備的芽孢桿菌菌懸液加滿孔，每個(gè)菌株加樣3個(gè)孔，置于適宜溫度下培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑(φ)，取平均值。判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：φ≤5 mm，不敏感；5 mm<φ≤10 mm，低度敏感；10 mm<φ<15 mm，中度敏感；φ≥15 mm，高度敏感。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

將病原菌材料接種于血瓊脂平板上，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，觀察發(fā)現(xiàn)，在接種脾臟組織的血瓊脂平板上出現(xiàn)完全溶血的菌落，命名為201706JS，血瓊脂平板鏡檢結(jié)果見圖1；在接種肝臟組織的血瓊脂平板上出現(xiàn)不溶血的較大不光滑菌落，命名為201706JL，血瓊脂平板鏡檢結(jié)果見圖2，2株分離菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)。其他組織接種后放置48 h仍無可疑菌落出現(xiàn)。

2.2 MALDI biotyper分析結(jié)果

MALDI biotyper分析發(fā)現(xiàn)，2株分離菌中的201706JS為短小芽孢桿菌(B.pumilus)，201706JL為巨大芽孢桿菌(B.megaterium)。

2.3 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及序列分析

2株分離菌的16S rRNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后[7]，出現(xiàn)大小為500 bp左右的目的條帶，將所測(cè)得的序列結(jié)果(圖3、圖4)在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，結(jié)果表明，所獲得的序列201706JS與短小芽孢桿菌(B.pumilus)(序列號(hào)：KU928365.1)的同源性為100%，201706JL與巨大芽孢桿菌(B.megaterium)(序列號(hào)：KY417160.1)的同源性為100%。

2.4 生化特性

由表1可知，2株分離菌均能發(fā)酵葡萄糖、果糖，并能夠水解淀粉，但不能水解乳糖、蔗糖等糖類，耐鹽試驗(yàn)呈陽性，MR、VP試驗(yàn)為陰性。

表1 2株分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

注：“-”表示陰性；“+”表示陽性。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，2株分離菌對(duì)常用抗生素強(qiáng)力霉素、諾氟沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、卡那霉素、 丁胺卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素、鏈霉素、左旋氧氟沙星等均敏感。

表2 2株分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 分離菌對(duì)其他細(xì)菌的抑菌性試驗(yàn)

由表3可知，雞源大腸桿菌對(duì)分離的短小芽孢桿菌(201706JS)和巨大芽孢桿菌(201706JL)都低度敏感，雞源金黃色葡萄球菌對(duì)短小芽孢桿菌(201706JS)低度敏感，但是雞白痢沙門菌對(duì)2株細(xì)菌均不敏感。

表3 2株分離菌對(duì)其他細(xì)菌的抑菌結(jié)果

3 討論

本研究從散養(yǎng)草雞的脾和肝中分別分離出短小芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌各1株，通過生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，分別為短小芽孢桿菌(B.pumilus)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)。這2株芽孢桿菌對(duì)強(qiáng)力霉素、諾氧沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素、鏈霉素、左旋氧氟沙星常用抗生素均敏感，由此可知，在臨床上使用抗生素不僅容易造成致病菌的耐藥性，更會(huì)殺滅益生菌，引起家禽體內(nèi)菌群失調(diào)，因此在家禽生產(chǎn)中不能一味使用抗生素，須全面考慮用藥的正面和負(fù)面影響。2株芽孢桿菌對(duì)常見病原菌尤其是對(duì)雞源大腸桿菌均有一定抑制性，初步具備了優(yōu)良的益生菌株條件，加上芽孢桿菌自有的較強(qiáng)可逆性和益生性，適合用作生產(chǎn)家禽微生態(tài)制劑[8-9]。但從已知的文獻(xiàn)可以看出，益生菌在體外試驗(yàn)中由于受各種因素以及細(xì)菌本身特性的影響，對(duì)致病菌的抑制性差異比較大，張紅英等在抑菌試驗(yàn)中將芽孢桿菌菌液濃縮10倍，獲得了較好的抑菌效果[10]，因此運(yùn)用此類芽孢桿菌生產(chǎn)微生態(tài)制劑用于抗菌抑菌時(shí)應(yīng)該注意加工和使用方法，這也是筆者所承擔(dān)2個(gè)基金項(xiàng)目研究中草藥配伍芽孢桿菌來替代抗生素的一個(gè)初衷。