棉花ERF-B3亞組轉(zhuǎn)錄因子基因GhERF5-1的克隆及表達(dá)

郭文婷， 張鵬飛， 李瀟玲， 張 析， 張 薇

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.)是一種真菌性土傳病害，由尖孢鐮刀菌引起?？菸?duì)棉花的生產(chǎn)發(fā)展造成了嚴(yán)重的損失。由于枯萎病病菌自身的一些傳播特點(diǎn)，傳統(tǒng)的防護(hù)措施及一些治病方法效果不是很理想，因此培育和種植抗枯萎病品種是一種有效的辦法。陸地棉種抗病基因資源較豐富，因此從陸地棉中分離抗枯萎病相關(guān)的基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可為海島棉抗枯萎病育種奠定基礎(chǔ)。

當(dāng)植物被病原菌侵染時(shí)會(huì)發(fā)生一系列的應(yīng)激防衛(wèi)反應(yīng)，其中一些植物的內(nèi)源性激素發(fā)揮重要作用。另外，一些轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病中扮演著重要角色，它們通過(guò)結(jié)合下游基因啟動(dòng)子中順式元件，調(diào)節(jié)下游防衛(wèi)基因。AP2/ERFBP轉(zhuǎn)錄因子中的ERF亞家族主要參與了植物體的生物和非生物脅迫下的應(yīng)答反應(yīng)。ERF亞家族轉(zhuǎn)錄因子只含有1個(gè)保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，一般由58～59個(gè)氨基酸殘基組成[1-2]。很多信號(hào)分子可以誘導(dǎo)ERF轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)病原菌侵染棉花時(shí)，棉花自身會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生許多小分子物質(zhì)，如乙烯(ethyl ene，簡(jiǎn)稱(chēng)ET)、水楊酸(salicylicacid，簡(jiǎn)稱(chēng)SA)、茉莉酸(jasmonicacid，簡(jiǎn)稱(chēng)JA)等激素，這些激素發(fā)揮信號(hào)分子的作用[3]，此外大多數(shù)ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病過(guò)程中處于信號(hào)交叉途徑，發(fā)揮著連接因子的作用[4]。莫紀(jì)波等研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子在不同的激素互作中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而激活了植物抗病信號(hào)途徑中的一些信號(hào)通路[4]。金莉研究發(fā)現(xiàn)，GbERF1轉(zhuǎn)錄因子基因通過(guò)增強(qiáng)抗病相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高棉花的抗病能力[5]。劉坤等克隆了GbEREB5和GbEREB6這2個(gè)屬B3亞組的轉(zhuǎn)錄因子基因，研究發(fā)現(xiàn)可以提高NtCHI-B、NtPR2等PR蛋白基因的表達(dá)量[6]。在作物中過(guò)量表達(dá)ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因，可以使下游的一些抗病基因和一些與抗病相關(guān)的基因呈上調(diào)表達(dá)，不僅提高了作物對(duì)某種單一病害的抗性，而且增加了作物對(duì)多種病害的抗病力[7]。轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病中具有更高的應(yīng)用價(jià)值。與轉(zhuǎn)入單一的抗病基因的轉(zhuǎn)基因方式相比，其能夠激活或抑制多個(gè)下游基因的表達(dá)，進(jìn)而獲得抗病力更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株[8]。目前，雖然棉花中ERF轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目較多，但是對(duì)它們功能的研究還不是很深入。在海島棉中，對(duì)抗枯萎病相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的研究有限，ERF轉(zhuǎn)錄因子與植物內(nèi)源性激素之間的互作尚不明確。本研究用對(duì)枯萎病病菌有差異表達(dá)的ERF為探針，克隆了ERF-B3亞組的轉(zhuǎn)錄因子基因GhERF5-1，利用生物信息學(xué)分析GhERF5-1基因的結(jié)構(gòu)、qRT-PCR技術(shù)分析GhERF5-1基因在枯萎病病菌處理下的表達(dá)模式，希望能夠?yàn)楹u棉抗病提供新的基因資源和為作物抗病分子育種提供有用的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為陸地棉品種中棉所12，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院育種教研室保存；枯萎病病菌菌株為F430，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)系張莉老師惠贈(zèng)。將籽粒飽滿(mǎn)的種子用10%的過(guò)氧化氫溶液浸泡2～3 h后，用ddH2O沖洗6遍后種植于蛭石中。當(dāng)棉苗長(zhǎng)出第1張真葉時(shí)，轉(zhuǎn)移到霍格蘭培養(yǎng)液中于(24±3) ℃、光照16 h、黑暗8 h在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待棉苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的棉苗，分別浸于濃度為1×107個(gè)/mL的枯萎病病菌孢子懸浮液、1 mmol/L乙烯、50 μmol/L 水楊酸和 1 mmol/L 茉莉酸甲酯的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中40 min，然后轉(zhuǎn)入霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中。以相同生長(zhǎng)條件下用水處理的棉苗作為平行對(duì)照Mock，分別在0、1、2、3、6、12、24、48 h時(shí)間點(diǎn)取處理棉苗和對(duì)照的根部組織，液氮冷激后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 利用筆者所在實(shí)驗(yàn)室得到的棉花抗枯萎病表達(dá)譜中的ERF序列為探針，在NCBI網(wǎng)站用tBlastn方式比對(duì)搜索，下載同源性高的ESTs序列；利用CAP3拼接軟件進(jìn)行ESTs的拼接，將拼接完整的序列進(jìn)行分析，找到其ORF后利用NCBI尋找其保守域；利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析所得電子序列與已知ERFB3亞組基因的親緣關(guān)系。使用Oligo 7設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物(上游引物F1：GGGGTACCATGGAAAGTAGCAGTGAAGTGTC；下游引物R1：CGGGATCCGATGACCGTAACTTGTTGAAAGC)。棉花總RNA的提取采用CTAB法，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期大小的基因片段，連接pMD19-T載體后，利用熱激法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和Cottongen數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)軟件分析GhERF5-1基因的開(kāi)放讀碼框、編碼蛋白的理化性質(zhì)、蛋白親疏水性、蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)等，多序列比對(duì)用DNAMAN軟件，用MEGA 5.0軟件做進(jìn)化樹(shù)分析。表1為所用的生物信息學(xué)分析軟件。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 根據(jù)目的基因的cDNA序列設(shè)計(jì)qRT-PCR上游引物Fq：CCTAAGCCCTTTGAATTTAC-ACCT和下游引物Rq：CCACTCTACTTTATGCGGTAACGA；以棉花的持家基因GhUBQ7作為內(nèi)參基因，上游引物Fu：GAAGACCTACACCAAGCCCAAG；下游引物Ru：CGGACTCTA-CTCAATCCCCACC。試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)重復(fù)，最后采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 生物信息學(xué)分析軟件及在線(xiàn)分析工具

2 結(jié)果與分析

2.1 基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

以筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期獲得的枯萎病病菌誘導(dǎo)棉花根部基因表達(dá)譜中有明顯差異表達(dá)的ERF數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用電子拼接方法得到1條長(zhǎng)度為990 bp的序列。用ORF Finder在線(xiàn)軟件分析得出，該基因開(kāi)放閱讀框(ORF)為990 bp，根據(jù)該ORF序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，以前期獲得的中棉所12的棉花根部cDNA為模板，擴(kuò)增出1條長(zhǎng)度約1 000 bp的片段(圖1)，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)為990 bp，與電子克隆序列一致，通過(guò)和擬南芥ERFB3亞組基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在進(jìn)化上與擬南芥B3亞組的AtERF5親緣關(guān)系最近，所以將該基因命名為GhERF5-1(GenBank登錄號(hào)：MF145657)。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 多序列比對(duì)及同源進(jìn)化分析 從NCBI下載10個(gè)已知擬南芥ERF-B3亞組的基因進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GhERF5-1基因編碼氨基酸序列在180～244之間，含有構(gòu)成了ERF亞族轉(zhuǎn)錄因子典型的AP2結(jié)構(gòu)域(圖2)。為了進(jìn)一步分析GhERF5-1基因與ERF亞族其他轉(zhuǎn)錄因子之間的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 5.0軟件，將該基因編碼的氨基酸與擬南芥的ERF-B3亞組氨基酸序列作同源進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果(圖3)表明，GhERF5-1基因編碼的蛋白與擬南芥AtERF5同處于1個(gè)分支，說(shuō)明該基因在進(jìn)化上與擬南芥ERF-B3亞組的基因AtERF5親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步說(shuō)明GhERF5-1基因?qū)儆贓RF-B3亞組。

2.2.2 基因編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析 對(duì)該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析可知，該基因編碼329個(gè)氨基酸，蛋白分子量為36.52 ku，分子式為C1 614H2 488N450O510S5，理論等電點(diǎn)為6.15。在組成這個(gè)蛋白的所有氨基酸中，所占比例最高的為絲氨酸(Ser)，達(dá)到12.5%。甲硫氨酸(Met)含量最低，為0.6%。蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為47.36，脂肪指數(shù)為61.12，總平均親水性為-0.701，預(yù)測(cè)該蛋白為1個(gè)親水的不穩(wěn)定蛋白。

2.2.3 基因編碼蛋白磷酸化分析和親疏水性分析 磷酸化和去磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中的重要形式之一[9]?；虻慕Y(jié)構(gòu)決定其功能，蛋白質(zhì)磷酸化在蛋白結(jié)構(gòu)功能的研究中具有重要的意義。利用NetPhos 3.1 serve(http：//www.cbs.dtu.dk/services/DetPhos/)預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)(圖4)，結(jié)果顯示，該蛋白總共含有29個(gè)絲氨酸、11個(gè)蘇氨酸和1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。因此推測(cè)在棉花上，GhERF5-1基因有可能被酪氨酸激酶、絲氨酸激酶、蘇氨酸激酶磷酸化修飾后激活調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控蛋白的活性。對(duì)GhERF5-1基因編碼的蛋白進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。在多肽鏈中，第258位的氨基酸親水性最強(qiáng)，分值為 -3.3；第310位的氨基酸疏水性分值最高，為1.2。說(shuō)明該蛋白是1個(gè)親水蛋白，進(jìn)一步說(shuō)明該蛋白是1個(gè)不穩(wěn)定蛋白。

2.2.4 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 對(duì)該基因編碼的蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。分析表明，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成元件是α螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲，β折疊只占15.81%。由圖6可知，GhERF5-1基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中最主要的結(jié)構(gòu)原件是以無(wú)規(guī)則卷曲的形式存在，α螺旋分散在整個(gè)蛋白中。蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析結(jié)果(圖7)顯示，該蛋白在 180～244之間是個(gè)高度保守的AP2結(jié)構(gòu)功能域，該結(jié)構(gòu)域是ERF亞家族共有的典型結(jié)構(gòu)域。AP2結(jié)構(gòu)保守域的C端序列是由18個(gè)氨基酸殘基組成的核心序列，形成雙親性的α螺旋參與了同DNA元件或其他轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用，N端的堿性親水區(qū)是由3個(gè)反向平行的β-折疊構(gòu)成[10]。三級(jí)結(jié)構(gòu)的同源建模分析，預(yù)測(cè)GhERF5-1轉(zhuǎn)錄因子基因的立體結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖8)表明，GhERF5-1轉(zhuǎn)錄因子的ERF結(jié)構(gòu)域與擬南芥的AtERF5的非常相似，由此推測(cè)GhERF5-1所編碼的蛋白可能有與AtERF5有相同的特性，可以與下游基因啟動(dòng)子中GCC-box結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)下游抗病基因的激活。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用qRT-PCR分析枯萎病病菌處理后GhERF5-1基因的表達(dá)。結(jié)果(圖9)發(fā)現(xiàn)，枯萎病病菌處理抗病品種中棉所12號(hào)后，該基因的相對(duì)表達(dá)量均高于平行對(duì)照Mock，為上調(diào)表達(dá)?？菸〔【秩竞?，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，GhERF5-1基因的表達(dá)趨勢(shì)是先增加后降低，在處理后2 h，該基因的相對(duì)表達(dá)量迅速增加，達(dá)到最大，是Mock的3倍，隨后表達(dá)量逐漸降低，48 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照Mock基本相同。由此可知，GhERF5-1基因?qū)菸∮忻黠@的響應(yīng)，推測(cè)該基因在棉花抗病中可能發(fā)揮一定的作用。

3 討論

ERF亞族作為植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在植物應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著很大作用。ERF-B3亞組轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與其下游PRs基因啟動(dòng)子中的GCC-box順式作用元件結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)控PRs基因的表達(dá)，如AtERF1通過(guò)結(jié)合PR基因PDF1.2啟動(dòng)子中的GCC-box， 從而激活其表達(dá)[11]。郭偉峰等從海島棉品種海7124中克隆了乙烯信號(hào)路徑的1個(gè)ERFs類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因GbERF1-like，研究發(fā)現(xiàn)其參與棉花的抗病反應(yīng)，在棉花抗黃萎病中有重要的調(diào)節(jié)作用[12]。何蘭蘭等利用電子克隆技術(shù)克隆了ERF-B3亞組轉(zhuǎn)錄因子基因GhB301，發(fā)現(xiàn)其對(duì)枯萎病有一定的響應(yīng)[13]。本試驗(yàn)利用電子克隆及RT-PCR技術(shù)，從棉花抗枯萎病品種中棉所12的根部cDNA克隆得到1個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子GhERF5-1，序列分析表明，該基因cDNA全長(zhǎng)990 bp，編碼329個(gè)氨基酸，無(wú)內(nèi)含子。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，GhERF5-1屬于ERF-B3亞組的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)該基因編碼的蛋白序列進(jìn)行同源比較及結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)該基因在180～244之間有1個(gè)高度保守的AP2結(jié)構(gòu)功能域。進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枯萎病病菌誘導(dǎo)后，該基因?qū)菸∮忻黠@的響應(yīng)，本試驗(yàn)結(jié)果與孟憲鵬對(duì)EREB1基因和EREB2在受到黃萎病菌的誘導(dǎo)后基因的表達(dá)分析結(jié)果[14]一致。

蛋白質(zhì)翻譯后的修飾最常見(jiàn)的是糖基化、磷酸化、甲基化和ADP核糖基化，其中蛋白磷酸化是十分重要的蛋白翻譯后修飾[9]。它是通過(guò)蛋白質(zhì)激酶的作用把磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上的一系列反應(yīng)[15]。植物通常通過(guò)蛋白之間的相互磷酸化或者自磷酸化來(lái)調(diào)整蛋白在體內(nèi)的活性[16]。研究發(fā)現(xiàn)，ERF轉(zhuǎn)錄因子基因含相對(duì)保守的一些磷酸化位點(diǎn)[17]，進(jìn)一步研究認(rèn)為，ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的磷酸化修飾可能與轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控或蛋白穩(wěn)定性有關(guān)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，GhERF5-1基因編碼蛋白含有29個(gè)絲氨酸、11個(gè)蘇氨酸和1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)該基因可能通過(guò)磷酸化反應(yīng)參與一些激素的信號(hào)通路，進(jìn)而響應(yīng)脅迫。

目前在棉花中對(duì)抗病相關(guān)的ERF-B3亞組基因研究不是很多，本試驗(yàn)克隆得到的基因初步分析對(duì)棉花枯萎病有一定的響應(yīng)，但是該基因在抗病調(diào)控途徑中具體的調(diào)控機(jī)制還不是很清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

生物信息學(xué)分析表明，該基因的cDNA全長(zhǎng)為990 bp，總共編碼329個(gè)氨基酸，分子量36.52 ku，等電點(diǎn)為6.15，編碼的蛋白是1個(gè)親水的不穩(wěn)定蛋白。qRT-PCR分析結(jié)果表明，枯萎病病菌侵染后，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，GhERF5-1基因的表達(dá)趨勢(shì)是先增加后降低，在處理后的2 h基因的相對(duì)表達(dá)量是5.91，達(dá)到最大，是Mock的3倍。從3 h起，相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，12 h的相對(duì)表達(dá)量最低，為0.19。