胃腸道間質(zhì)瘤的基因研究進(jìn)展

糜睿 綜述 丁杰，董奇，蔣專，劉航，劉振華，張龍鳳，張忠民 審校

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550000；2.貴州省人民醫(yī)院 胃腸外科，貴州 貴陽(yáng) 550000）

1983年，Mazur和Clark首先將胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）區(qū)別于其他胃腸道間葉源性腫瘤獨(dú)立提出。GISTs是消化系統(tǒng)最常見的間葉組織源性腫瘤，獨(dú)立起源于Cajal細(xì)胞（或胃腸道間質(zhì)干細(xì)胞），具有不定向分化特性，在組織形態(tài)學(xué)上由未分化或多潛能的梭形或上皮樣細(xì)胞組成。KIT或血小板源性生長(zhǎng)因子受體α（PDGFRA）等基因突變，導(dǎo)致酪氨酸激酶持續(xù)的活化引起細(xì)胞增殖分化失控是其發(fā)病的主要原因[1-2]。GISTs發(fā)生于消化道的各個(gè)部位，病理表現(xiàn)：分界清楚，球形或半球形，質(zhì)韌，表面呈結(jié)節(jié)或分葉狀，單發(fā)或多發(fā)，大小不等。GISTs復(fù)發(fā)率比較高，多為局部復(fù)發(fā)，周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較少見。GISTs的基因研究是目前的熱點(diǎn)，可以為其診斷及治療打開新思路。本文對(duì)近些年針對(duì)GISTs發(fā)生、進(jìn)展、診斷、預(yù)后及耐藥相關(guān)的基因研究進(jìn)行總結(jié)。

1 GISTs發(fā)生的相關(guān)基因

1.1 KIT

約80%的GISTs中存在KIT基因突變。KIT屬III型受體酪氨酸激酶家族，KIT由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，近膜結(jié)構(gòu)域，酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域I和酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域II組成，通過激酶結(jié)構(gòu)域的自身抑制將KIT維持在無(wú)活性形式。干細(xì)胞因子（SCF）是一種KIT配體，其結(jié)合促進(jìn)ATP與酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)合以及近膜結(jié)構(gòu)域中酪氨酸殘基的自動(dòng)磷酸化，SCF-KIT信號(hào)通路激活下游途徑[3]，包括MAP激酶級(jí)聯(lián)和PI3K/Akt途徑，前者導(dǎo)致MYC、ELK、CREB和FOS等轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)，而后者導(dǎo)致細(xì)胞周期抑制因子的下調(diào)及促進(jìn)抗細(xì)胞凋亡作用[4]。KIT突變常發(fā)生于幾個(gè)區(qū)域，包括外顯子8、9、11、13、14、15和17，其突變類型以缺失突變、點(diǎn)突變、混合突變和插入突變?yōu)橹鳌IT基因突變以外顯子11最為常見，其憑借激酶結(jié)構(gòu)域的自身抑制，保持非活性形式，而外顯子11的突變破壞自身抑制并導(dǎo)致KIT的持續(xù)激活，與患者年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、腫瘤大小、核分裂象及CD34表達(dá)有關(guān)。KIT基因外顯子11突變中，缺失突變主要位于5'端，點(diǎn)突變主要集中在556～560密碼子，重復(fù)突變主要位于3'端。而KIT基因外顯子9突變特點(diǎn)為502～503密碼子的重復(fù)突變，發(fā)生于小腸，瘤體較大，年齡較大（＞60歲），多為女性并具有梭形細(xì)胞形態(tài)。外顯子13和17突變均為點(diǎn)突變[5]?，F(xiàn)將各突變位點(diǎn)歸納如表1。

表1 KIT突變位點(diǎn)首次發(fā)現(xiàn)時(shí)間及特點(diǎn)Table 1 First detection times and significance of mutation sites of KIT gene

1.2 PDGFRA

PDGFRA基因的突變率低于KIT基因，約占總數(shù)的5%～10%。PDGFRA基因與KIT基因位于相同染色體的相鄰位置，兩者氨基酸序列同源性較高，它們的突變以互相排斥的方式發(fā)生。PDGFRA突變見于外顯子12、14、18突變[6]?，F(xiàn)將各突變位點(diǎn)歸納總結(jié)如表2。

表2 PDGFRA突變位點(diǎn)首次發(fā)現(xiàn)時(shí)間及特點(diǎn)Table 2 First detection times and significance of mutation sites of PDGFRA gene

PDGFRA突變型GISTs多見于胃，具有上皮樣形態(tài),有肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)，表現(xiàn)為惰性。對(duì)于KIT弱免疫反應(yīng)或不反應(yīng)的GISTs存在分泌黏液基質(zhì)的上皮樣細(xì)胞，即黏液上皮樣GISTs[7]。約10%無(wú)KIT基因突變的GISTs攜帶PDGFRA突變，此類GISTs，聯(lián)合組織形態(tài)學(xué)及免疫染色法可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)PDGFRA突變的基因型[8]。

GISTs中KIT和PDGFRA基因突變率高且突變類型多樣，不同外顯子突變以及同一外顯子的不同突變類型均具有一定的獨(dú)特性，可為臨床個(gè)體化治療提供參考。

1.3 野生型

約10%～15%的GISTs無(wú)KIT或PDGFRA基因突變，稱為野生型GISTs，CD117陽(yáng)性或陰性表達(dá)，符合GISTs病理學(xué)改變[9]。但實(shí)際操作中檢測(cè)技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)存在一定的缺陷，所以部分野生型GISTs同樣存在KIT和PDGFRA基因突變，有報(bào)道[10]野生型GISTs仍可檢測(cè)到少數(shù)KIT外顯子8或10的突變。野生型GISTs對(duì)酪氨酸激酶抑制劑治療無(wú)效，并發(fā)現(xiàn)其中存在琥珀酸鹽脫氫酶復(fù)合物、BRAF或NF-1等基因突變[11]。

1.3.1 琥珀酸鹽脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）功能缺乏型GISTs 腎癌、副神經(jīng)節(jié)瘤、垂體瘤等存在SDH功能的缺乏，一部分GISTs亦如此。約7.5%的GISTs存在SDH功能缺乏，且其發(fā)生不受KIT或PDGFRA基因突變所驅(qū)使[12]。約半數(shù)野生型GISTs存在SDH功能缺乏。SDH復(fù)合體由SDHA，SDHB，SDHC，SDHD 4個(gè)亞基組成，在電子傳遞及能量轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用[13]。SDH缺乏型GISTs中，SDH復(fù)合體任一亞基的編碼基因鈍化突變或表觀遺傳改變（SDHC啟動(dòng)子甲基化）會(huì)導(dǎo)致SDH復(fù)合體失穩(wěn)定，使SDH缺乏、琥珀酸鹽異常集聚，低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1-α）集聚及HIF1-α受控的原癌基因過度表達(dá)，產(chǎn)生假性缺氧信號(hào)[14]。同時(shí)IGF1R及VEGFR所介導(dǎo)的信號(hào)通路上調(diào)，抑制IGF1R可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制GISTs細(xì)胞中的AKT和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)。該類GISTs主要表現(xiàn)Carney三聯(lián)征（多發(fā)的胃間質(zhì)瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、肺軟骨瘤）或Carney-Stratakis綜合征（有遺傳傾向的多發(fā)的胃間質(zhì)瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤），兒童及青少年多見，僅有10%發(fā)生于成人。進(jìn)展較緩慢，甚至在腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)年后，許多患者仍能生存，普遍有淋巴血管侵襲[15-16]。

1.3.2 I型神經(jīng)纖維瘤病（neurofibromatosis 1，NF-1）相關(guān)型GISTs NF-1是17號(hào)染色體上NF-1基因突變所致的一類常染色體顯性腫瘤綜合征，特征為咖啡牛乳色斑，神經(jīng)纖維瘤，嗜鉻細(xì)胞瘤以及某些情況下的GISTs。約5%～25%的NF-1患者發(fā)生GISTs，而NF-1患者GISTs的患病率是普通人群的至少45倍。NF-1相關(guān)型GISTs無(wú)KIT/PDGFRA突變，也無(wú)SDH功能缺乏[17]。表現(xiàn)為多中心集中于小腸的腫瘤，核分裂活性較低，預(yù)后良好，不易轉(zhuǎn)移。但當(dāng)此類腫瘤發(fā)生于十二指腸時(shí)通常表現(xiàn)出侵襲特性，易轉(zhuǎn)移。對(duì)于其預(yù)后目前仍存在爭(zhēng)議。研究發(fā)現(xiàn)1/3以上的NFI相關(guān)型GISTs表達(dá)S-100蛋白，1/5的十二指腸GISTs中S-100呈現(xiàn)不同程度的表達(dá)，散發(fā)性小腸GISTs中S-100蛋白常不表達(dá)（6%）[18]。

1.3.3 BRAF基因突變型GISTs 13%的野生型GISTs中發(fā)現(xiàn)BRAF第15號(hào)外顯子突變，其中BRAF V600E基因突變可見于7%的野生型GISTs中，被認(rèn)為是一種野生型GIST的發(fā)病機(jī)制。這種突變常見于甲狀腺乳頭狀癌、黑色素瘤。BRAF是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RAF家族的一員，涉及RAS-RAF-ERK信號(hào)通路，通過激活MPAK通路調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)。BRAF位于KIT下游，V600E位于BRAF激酶區(qū)域，突變導(dǎo)致不依賴于KIT的細(xì)胞生長(zhǎng)，BRAF突變腫瘤對(duì)KIT抑制劑治療并不敏感[19]。突變BRAF與Rac1b，AKT3和其他信號(hào)分子協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞活性和增殖。由于BRAF突變?cè)谥睆? mm的小GISTs中被發(fā)現(xiàn)，它被認(rèn)為是GIST發(fā)展中最早發(fā)生的事件之一。研究對(duì)比無(wú)BRAF基因突變的GISTs，BRAF突變型GISTs并無(wú)B-raf蛋白的高表達(dá)及MAPK信號(hào)通路的優(yōu)先激活，由于結(jié)論的不一致性，BRAF突變是否與野生型GISTs發(fā)病相關(guān)尚未得到共識(shí)。KIT、PDGFRA、BRAF基因均不能被檢出突變的GISTs被稱之為“三陰型GISTs”。

1.3.4 其他基因突變型GISTs KRAS基因突變可同時(shí)存在于KIT突變型GISTs和野生型GISTs中[20]。原發(fā)性GISTs中EGFR[21]突變近來(lái)被發(fā)現(xiàn)，并且不與KIT、PDGFRA、KRAS或BRAF突變重疊。此外，BRCA1和BRCA2是乳腺癌和卵巢癌中的腫瘤抑制基因，有報(bào)道[22]BRCA2和GISTs之間有潛在關(guān)聯(lián)。

1.4 家族性GISTs

KIT或PDGFRA的種系突變導(dǎo)致了家族性的GISTs綜合征的發(fā)生，表現(xiàn)為多發(fā)的GISTs、過度色素沉著、肥大細(xì)胞和Cajal細(xì)胞增生相關(guān)性的吞咽困難。在家族性GISTs中發(fā)現(xiàn)KIT或突變PDGFRA，KIT突變包括外顯子11中的p.V559A，c.1756_1758delGAT和p.W557R，外顯子8中密碼子419缺失和外顯子17中的D820Y取代。PDGFRA突變包括外顯子18中的錯(cuò)義突變（D846Y），PDGFRA D846與KIT D820同源，位于酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)[23]。

2 GISTs疾病進(jìn)展的相關(guān)基因

部分GISTs患者術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移并因此死亡，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是進(jìn)一步改善GISTs預(yù)后的瓶頸[24]。筆者所在團(tuán)隊(duì)通過免疫組化檢測(cè)GISTs中Twist、E鈣黏蛋白及N鈣黏蛋白的表達(dá)并分析其間臨床病理特征得知：GISTs發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者Twist顯著高表達(dá)而E鈣黏蛋白顯著低表達(dá)，兩者的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[25]。另一項(xiàng)研究同樣支持在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的GISTs組織中E鈣黏蛋白顯著低表達(dá)，而另一轉(zhuǎn)錄因子Slug顯著高表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)，與GISTs的轉(zhuǎn)移密切聯(lián)系[26]，高表達(dá)slug患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率降低[27]。Wang等[28]通過免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)KIT外顯子11的缺失（包括密碼子557-558）與肝臟轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，密碼子557-558過度表達(dá)增加CXCR4和ETV1的表達(dá)，而CXCR4沉默能夠抵抗外顯子557-558介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并且，ETV1沉默可抵抗密碼子557-558介導(dǎo)的CXCR4表達(dá)。KIT外顯子11 557-558密碼子依靠增加GISTs細(xì)胞中ETV1及CXCR4啟動(dòng)子的結(jié)合使CXCR4上調(diào)。另外，Brahmi等[29]通過一組隨機(jī)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KIT（L541）基因型有更高的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

3 GISTs診斷的相關(guān)基因

對(duì)于GISTs而言，CD117及DOG1的免疫組化檢測(cè)可為其提供診斷依據(jù)[30]，同時(shí)CD34、平滑肌肌動(dòng)蛋白、h-鈣黏蛋白、PKCθ也有表達(dá)[31]，但缺乏特異性。

microRNA（miRNA）參與轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄抑制或促進(jìn)mRNA降解[32]，miRNA表達(dá)譜可能成為腫瘤診斷和判斷預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。miRNA在GISTs中直接參與調(diào)控KIT基因的表達(dá)水平，并且可阻止GISTs細(xì)胞的增殖[33]。在GIST中，miR-16上調(diào)及mi-10下調(diào)明顯[34]，相比其他外周組織，GISTs中miR-221以及miR-222也顯著下調(diào)[35]，非野生型GISTs中miR-221以及miR-222的下調(diào)更顯著。胃與腸道高表達(dá)的miRNA不同，KIT及PDGFRA型高表達(dá)的miRNA也不相同，miR-210、miR-220c、miR-329、miR-376c高表達(dá)于小腸GISTs，miR-15高表達(dá)于PDGFRA型GISTs[36]。miRNA的表達(dá)模型可用于區(qū)分GISTs的分子分類，且與腫瘤風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)或發(fā)生部位密切相關(guān)[33]，了解GISTs的基因譜對(duì)于最合適治療方案的選擇至關(guān)重要。

以往，BRAF V600E突變常使用測(cè)序相關(guān)的技術(shù)進(jìn)行，BRAF V600E突變特異抗體VE1對(duì)GISTs中檢測(cè)BRAF突變具有良好的特異性及敏感性，通過免疫組化即可有效檢測(cè)BRAF V600E突變[37]。SDH突變型的GISTs可通過免疫組化的方法可檢測(cè)到SDHB亞基的缺失[17]。

4 GISTs治療及耐藥的相關(guān)基因

伊馬替尼是治療不可切除以及轉(zhuǎn)移性GISTs的一線藥物，80%的患者對(duì)其有臨床效應(yīng)，尤其對(duì)于KIT外顯子11突變型，而對(duì)于KIT外顯子9突變型需加大藥物劑量[38]。然而，即便多數(shù)患者有長(zhǎng)久性的臨床獲益，仍有相當(dāng)一部分患者腫瘤存在進(jìn)展。少數(shù)患者發(fā)生原發(fā)耐藥和超過半數(shù)患者發(fā)生繼發(fā)耐藥[39]。

4.1 原發(fā)耐藥

伊馬替尼的原發(fā)耐藥更多發(fā)生于野生型GISTs，原因主要在于野生型GISTs發(fā)病機(jī)制與KIT或PDGFR基因突變無(wú)關(guān)[40]。另一原發(fā)耐藥的GISTs類型為PDGFRA外顯子18D842V突變GISTs，這一類型患者對(duì)絕大多數(shù)酪氨酸激酶抑制劑會(huì)發(fā)生原發(fā)耐藥[41]，此外，KIT V559D型GISTs 也會(huì)發(fā)生原發(fā)耐藥[42]。

4.2 繼發(fā)耐藥

伊馬替尼繼發(fā)耐藥是轉(zhuǎn)移性GISTs的治療難題。目前已明確的繼發(fā)耐藥機(jī)制為KIT或PDFRA的繼發(fā)突變，最常見的突變位點(diǎn)位于ATP結(jié)合區(qū)（KIT外顯子13、外顯子14）和kit活化環(huán)（外顯子17、外顯子18），仍有約50% GISTs在伊馬替尼耐藥之后并未發(fā)生KIT基因繼發(fā)突變[43]，但機(jī)制尚未明確。抑癌基因PTEN表達(dá)下調(diào)或丟失可導(dǎo)致AKT過度活化而抵抗腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對(duì)TKIs產(chǎn)生耐藥[44]。舒尼替尼對(duì)外顯子13和14突變KIT型GISTs顯示出相對(duì)更好的療效，其對(duì)不同突變型GISTs抑制存在差異，可為耐藥后GISTs的精準(zhǔn)治療提供藥物選擇。

5 GISTs預(yù)后的相關(guān)基因

近10年GISTs患者的預(yù)后有較大改善，但部分預(yù)后仍較差。其中，KIT基因突變的頻率對(duì)GISTs的惡性程度有一定影響，其突變頻率越高，瘤體越大，核分裂象數(shù)也越高[45]。基因改變的確切類型具有很強(qiáng)的臨床預(yù)后價(jià)值。如：KIT外顯子9突變比外顯子11突變型的GISTs更易發(fā)生進(jìn)展，KIT外顯子11缺失型患者5年無(wú)病生存率高于KIT外顯子11突變型。KIT基因外顯子11第557-558密碼子的缺失與腫瘤的侵襲性轉(zhuǎn)移表型有關(guān)，提示總體預(yù)后不良，與其他外顯子11突變的患者相比，其5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率降低23.8%[46]。KIT基因突變型中，內(nèi)含子10/外顯子11連接缺失將導(dǎo)致p.K550_K558缺失，提示腫瘤可能具有高侵襲性的臨床行為。胃部KIT外顯子13突變型GISTs的平均體積稍大，危險(xiǎn)度相對(duì)高。具有PDGFRA突變和KIT外顯子11置換或重復(fù)型突變的GISTs患者5年復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較低，具有PDGFRA外顯子14突變的GISTs預(yù)后相對(duì)良好（僅限于胃），幾乎只有上皮形態(tài)[47]。

6 總結(jié)與展望

綜上，GISTs相關(guān)基因分型的研究為其個(gè)體化治療提供了重要依據(jù)，基因分型對(duì)GISTs的治療逐漸受到重視，對(duì)評(píng)估預(yù)后具有一定價(jià)值。對(duì)耐藥基因相關(guān)的研究，可解決目前伊馬替尼等耐藥的棘手問題。通過對(duì)GISTs基因相關(guān)的研究，其發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制將日漸被闡明，進(jìn)一步改善GISTs治療效果，使患者獲得長(zhǎng)期生存。